WB?實驗結果有黑點 |
原因 | 解決方案 |
封閉液未溶解完全 | a.?確認奶粉完全溶解。出現(xiàn)黑點最常發(fā)生的原因是奶粉沒有完全溶解,建議加入攪拌子,增加攪拌時間,或是溶解后離心取上清液使用。 b.?利用0.45 um的濾紙過濾溶液,以除去未溶解的牛奶顆粒及其他雜質。 c.?改變封閉液的種類,如換為BSA。 |
溶液污染 | a.?使用新鮮配制的溶液?(跑膠、轉膜、封閉、洗脫等緩沖液)或商業(yè)化溶液,以減少因長菌長霉造成的黑點。 b.?確認一抗溶液是否保存不當,可嘗試重新配置一抗溶液。 |
封閉液及抗體交互作用 | 一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白,可能會與磷酸化抗體產生非特異性結合,因此,如使用磷酸化抗體,建議用BSA作為封閉溶液,同時洗脫溶液也用TBST,如此可降低黑點或高背景值狀況。 注:a.?TBST是以Tris為基底,PBST是以磷酸鹽為基底的緩沖液,一般根據(jù)習慣選擇使用TBST或PBST。但如果是操作磷酸化抗體或最終顯色分析是用AP系統(tǒng)時,因為PBST中的磷酸根會干擾,可能會造成高背景值或無信號,此時建議使用TBST緩沖液。另外,同一次實驗中請使用一種緩沖液,不可封閉液用PBST,洗脫液用TBST。 b.?封閉時一般使用3-5%封閉溶液,依實驗特性不同,可做微調;牛奶與BSA的選擇也是相同,掌握原則后,再依實驗特性做微調,就能快速上手。 |
WB實驗結果信號過曝 |
原因 | 解決方案 |
蛋白樣品過量 | 降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50 ug,但有些蛋白的表達量較高(如beta actin),此時可依蛋白表現(xiàn)量,調整上樣量。 |
抗體過量 | a.?提高抗體稀釋倍數(shù)。產生過曝時可提高一抗、二抗的稀釋倍數(shù)。 b.?減少孵育時間 c.?于4℃孵育 |
信號過曝 | a.?縮短曝光時間。過曝時可縮短曝光時間,減少過曝的情形。 b.?使用低靈敏度的化學發(fā)光底物。過曝現(xiàn)象也有可能是因為化學發(fā)光底物過強導致的,?可選用靈敏度較低的化學發(fā)光底物來改善。 注:化學發(fā)光底物一般有三種等級,femto(飛克, 10-15g),?pico(皮克, 10-12g),?及plus(低皮克級, 10-12~ 10-9g),可依蛋白表達量挑選適合的化學發(fā)光底物。 |
WB實驗結果拖帶 |
原因 | 解決方案 |
樣本不純,有雜質污染 | a.?重新離心樣品后取上清液使用 b.?使用較純的試劑配置細胞裂解液或購買商業(yè)化產品 c.?使用Benzonase?核酸酶。Benzonase?核酸酶能迅速水解核酸,降低蛋白樣品粘度,減少核酸對跑膠的干擾 d.?全細胞或亞細胞萃取。使用商業(yè)化全細胞或亞細胞萃取試劑盒提取蛋白樣品,減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。 |
蛋白樣品過量 | a.?降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50ug,但有些蛋白表達量較高(如beta actin),此時可依蛋白表達量,進行微調。 b.?延長加熱時間。蛋白變性不完全,?也會使條帶成團拖尾,此時可通過延長樣品加熱時間(一般約5分鐘)及調整SDS(一般是2 %)比例,?使蛋白變性更完全。 |
信號過曝 | a.?縮短曝光時間。過曝時可縮短曝光時間,?減少過曝的情形。 |
b.?使用低靈敏的化學發(fā)光底物。過曝現(xiàn)象可能是因為化學發(fā)光底物過強導致的,?可選用靈敏度較低的化學發(fā)光底物來改善。 |
WB條帶扭曲 |
原因 | 解決方案 |
膠沒配置好 | a.?確保APS & TEMED?正常,?并新鮮配置膠體。 APS為起始劑,主要負責提供自由基供膠體進行聚合反應,?APS粉末容易受潮,建議置于防潮箱保存,如果發(fā)生結塊,建議重新購買。TEMED為催化劑,如果保存不當或過期,也會影響膠體聚合,建議分裝。 b.?小心移除齒梳,避免造成加樣壁孔歪斜 c.?配完下層膠后,需用水或醇類將膠體壓平 d.?膠里面有雜質/氣泡。可預先用0.45 um濾紙過濾膠體溶液,混合膠體溶液時,應避免產生氣泡。 |
電流電壓問題 | a.?避免用高電壓電泳使膠體過熱。?150V,過熱有霧氣,80-100V,上膠帶短、下層不勻。 b.?空的孔道加樣品緩沖液,使每個孔洞都有樣品且鹽類成分相近。 c.?避免孔洞中有雜質,用高純度等級的化學藥品或用商業(yè)化試劑提取蛋白樣品,或在上樣前用跑膠緩沖溶液沖洗加樣孔。 |
轉膜問題 | a.?膠體應與膜密合,轉膜時小心滾壓膠體,使膠體與膜貼合緊實 b.?轉膜時小心勿晃動。有時出現(xiàn)?2個條帶是因為轉膜時發(fā)生晃動,產生疊影 條帶呈啞鈴狀 出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配置好,膠凝固后不均一,拔完梳子之后,某些孔道凸起不平整,可以試著注意膠體是否凝固完全(確認試劑沒問題),拔梳子時注意不要讓孔道歪掉,loading前也可以再用running buffer沖洗孔道,另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質,沒有離心下來,或沒有溶解,然后雜質沉積在孔的中間,蛋白因此被推擠到兩邊。 |
條帶呈啞鈴狀 | 原因:出現(xiàn)啞鈴狀最可能是膠沒有配制好,膠凝固后不均,拔完齒梳之后,某些孔道凸起不平整,另一種可能是樣品中含有過多雜質,沒有離心下來,或沒有溶解,導致雜質沉積在孔的中間,蛋白因此被推擠到兩邊。 解決方案:確認膠體是否凝固完全,拔齒梳時注意不要讓孔道歪斜,上樣前可再用跑膠緩沖液沖洗孔道。 |
WB背景值較高 |
原因 | 解決方案 |
封閉不足 | a.?提高封閉液濃度,確保封閉液完全覆蓋轉印膜,如使用5%?脫脂奶粉或BSA。 b.?增加封閉時間,一般情況會使用37℃封閉1小時,可視情況調整封閉的條件。 c.?使用BSA作為封閉液,同時搭配使用TBST的洗脫液來降低高背景值的狀況。 |
抗體問題 | a.?抗體濃度太高。建議降低抗體濃度,并增加洗滌次數(shù)和時間。 b.?一抗孵育溫度過高,建議4℃孵育過夜。 c.?二抗的非特異性背景,可增加二抗對照,以陽性對照組確認二抗。 d.?洗脫不足,增加洗脫液體積和洗滌次數(shù)。 |
顯色問題 | 化學發(fā)光底物過多,建議調整化學發(fā)光底物,按說明書加入適量的顯色底物。也可依據(jù)蛋白表達量的不同,選擇合適的化學放光底物。 |
膜的問題 | a.?挑選合適的NC或PVDF膜。依據(jù)靶標蛋白、想要呈現(xiàn)的實驗結果及膜的特性,選擇出適合實驗的材料。 b.?建議實驗過程中都必須注意讓膜保持濕潤,特別是PVDF膜。 c.?在使用PVDF膜時可能會出現(xiàn)浸潤不均勻的情況,從而導致背景值比較高的情況。因此,建議使用PVDF膜前使用100% methanol完全浸潤膜。 |
WB條帶非專一性 |
原因 | 解決方案 |
蛋白質降解 | a.?蛋白質抑制劑或磷酸酶抑制劑 b.?冰上操作 c.?避免反復凍融 |
蛋白質形成多聚糖 | a.?使用現(xiàn)配的DTT/2-ME,并將加熱時間延長 b.?確認樣本煮沸時的溫度達到95-100℃ |
確認蛋白質特性 | 查詢生物信息確認蛋白是否存在后修飾、剪切體等。 |
抗體濃度過高或蛋白樣品過量 | a.?調整蛋白上樣量為30-50 ug或減少上樣量 b.?增加抗體稀釋倍數(shù) |
抗體非專一性結合 | a.?增加洗膜次數(shù)與除垢劑強度 b.?設對照組確認抗體專一性 c.?詢問抗體公司技術支持 |
抗體認到輕重鏈的信號 | a.?換不同宿主來源的一抗 b.?使用EasyBlot二抗 |
目標信號微弱 |
原因 | 解決方案 |
蛋白問題 | a.?了解靶標蛋白的特性 ??是否存在特異性??可提取特定細胞器增加蛋白濃度,例:抽取核蛋白、膜蛋白、胞質蛋白。 ??是否存在組織特異性??有些目標蛋白只會在特定組織表達,這可降低樣本挑選的錯誤率。 ??是否有后修飾作用??目標蛋白后修飾分子量會變大,使抗體認到的位置比估算分子量高。 ??確認靶標蛋白在細胞株的表達量以及是否需加藥誘導蛋白表達。 b.?增加蛋白質上樣量。一般蛋白上樣量為20-30μg/孔,?如文獻已表明靶標蛋白表達量低或是使用極少的上樣量(例如< 10μg),需增加上樣量來協(xié)助抗體偵測其信號。 c.?減少蛋白降解。 ??細胞萃取時要加蛋白質抑制劑或磷酸酶抑制劑,避免蛋白降解。 ??在冰上操作蛋白質實驗。 ??避免反復凍融樣品(建議分裝)。 ??新鮮制備新一批的樣本。 |
抗體問題 | a.?調整抗體孵育條件。 ??增加抗體量,例如原本使用1:1000稀釋,調整為1:500稀釋。 ??增加孵育時間:將原37℃孵育1小時改成4℃孵育過夜。 b.?一抗二抗不相容。檢查二抗與一抗種屬是否有正確配對,要訣:“鼠配鼠兔配兔,isotype相配不出錯”。 c.?過度洗脫。減少洗脫次數(shù)與時間:一般洗脫三次,?每次5-10分鐘即可。 |
轉膜問題 | a.?檢查轉膜方向。轉膜方向錯誤會讓蛋白往反方向移動散逸在轉膜緩沖液里,方向正確才能讓蛋白粘附咋轉印模的孔洞里。 b.?根據(jù)分子量調整轉膜條件。大分子蛋白轉膜條件可調整為低溫過夜(濕式轉膜),小分子蛋白改用0.2 um的轉印膜,縮短轉膜時間。 |
封閉過度 | a.?降低封閉液濃度:一般使用3-5%的牛奶或BSA做封閉液即可。 b.?降低封閉時間:一般封閉時間為30-60分鐘。 c.?換封閉液,可使用商業(yè)化封閉液(GTX30963)可協(xié)助避免這個問題的發(fā)生。 |
化學發(fā)光底物失活或敏感度不夠 | a.?使用現(xiàn)配的化學發(fā)光底物 b.?使用高敏感度的化學發(fā)光底物,例如使用飛克(GTX14698)等級的化學發(fā)光底物。 c.?增加曝光時間 |