什么是內(nèi)參?
Western Blot常用來比較不同條件下或不同細(xì)胞組織中目標(biāo)蛋白表達(dá)量的相對多少,因此必須先確定上樣量相同,才有比較的基礎(chǔ)。在Western Blot實(shí)驗(yàn)中,可能因總蛋白濃度測定不準(zhǔn)確,或是蛋白質(zhì)上樣時(shí)因操作產(chǎn)生誤差,所以必須設(shè)置內(nèi)部參照組來進(jìn)行校正。此內(nèi)部參照必須在不同細(xì)胞或組織間表達(dá)相對恒定,且有高水平的表達(dá)量,來確保不同樣品間蛋白定量相同。而這樣的參照蛋白,就稱為內(nèi)參,對應(yīng)的抗體就稱為內(nèi)參抗體。
內(nèi)參在WB實(shí)驗(yàn)中的重要性。
1 用于校正蛋白水平,確保不同樣品間蛋白定量(上樣量)相同??蓮臈l帶粗細(xì)初步判定上樣量是否有差異。進(jìn)一步使用影像分析程序?qū)⒛繕?biāo)蛋白量除以內(nèi)參含量,所得到的數(shù)值即為校正后的目標(biāo)蛋白相對含量,如此就可以進(jìn)行目標(biāo)蛋白相對量的比較。
2 確認(rèn)轉(zhuǎn)膜、顯色等步驟是否均勻轉(zhuǎn)移、呈色。內(nèi)參一般選用高表達(dá)的蛋白,因此也可通過內(nèi)參的條帶,觀察WB實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)膜、顯色等步驟是否有異常。
3對文章發(fā)表絕對重要,增加實(shí)驗(yàn)的可信度。文章內(nèi)放上內(nèi)參的數(shù)據(jù),較有說服力,文獻(xiàn)審核者也會較相信實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
如何挑內(nèi)參抗體
通常會挑選各細(xì)胞或組織間穩(wěn)定表達(dá)、并且不受實(shí)驗(yàn)影響的蛋白作為內(nèi)參,但不同的實(shí)驗(yàn)還是有一些細(xì)節(jié)要注意,挑選內(nèi)參可參考下面四點(diǎn):
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常用內(nèi)參請見下表:
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