通常我們在做Western blot實驗中，會用到固相載體（如NC膜，PVDF膜），在這些固相載體表面有很多洞洞，通過電轉(zhuǎn)，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到膜上，蛋白以機械填補（堆積）和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是連續(xù)的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。
封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結(jié)合，同樣以機械填補（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因為有“填補”和覆蓋“蛋白結(jié)合位點以避免一抗的非特異性結(jié)合，所以有”封閉“的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固的結(jié)合在空白位置上，這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結(jié)合。
封閉液應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點而不替換表面上的靶蛋白，不結(jié)合靶蛋白表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。
常見的封閉液：
1.BSA? BSA是最常用的封閉液，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的，BSA有很強的免疫原性，會導(dǎo)致產(chǎn)生很多針對BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA，脫脂奶粉封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。
2.血清? 封閉血清的原理主要有兩點，第一是待測樣本有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分分特異性的結(jié)合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。第二待測樣品中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結(jié)合，BSA無法封閉Fc受體。
3.脫脂奶粉? 脫脂奶粉最大的優(yōu)點是價格便宜，但由于成分相對復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導(dǎo)致背景增加，此外，因為自身含有生物素，不能用于生物素標記的抗體系統(tǒng)。脫脂奶粉種含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標記的二抗時，也會使得高背景或本底水平增高。
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