收到細(xì)胞后，首次進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)該注意些什么？
收到細(xì)胞后最重要的步驟是解凍，但亞洲的客戶無(wú)需進(jìn)行此步驟，因?yàn)镮nvivogen將細(xì)胞運(yùn)往亞洲地區(qū)時(shí)使用的是細(xì)胞培養(yǎng)板在常溫下運(yùn)輸。收到細(xì)胞后需要立馬進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不要放在-80℃或者液氮中，因?yàn)檫@會(huì)損傷細(xì)胞。
我在HEK和THP1細(xì)胞的初始培養(yǎng)過(guò)程中有困難，請(qǐng)問(wèn)有什么建議可以參考嗎？
如果您在初始培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中遇到任何問(wèn)題，請(qǐng)參考以下的建議：
●?對(duì)于前2-3次傳代的細(xì)胞，應(yīng)置于含20%胎牛血清且無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。但此條件下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，2-3代之后的細(xì)胞應(yīng)使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
●?請(qǐng)定期檢查細(xì)胞狀態(tài)，不要使細(xì)胞的匯合度達(dá)到100%。
●?當(dāng)凍存細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)繼續(xù)培養(yǎng)其他未凍存的細(xì)胞，以防凍存細(xì)胞有問(wèn)題。
如果你正在培養(yǎng)THP1細(xì)胞，以下是額外需要注意的地方：
●?對(duì)于THP1細(xì)胞，我們建議細(xì)胞濃度在3 x 105?-7 x 105?cells/mL時(shí)進(jìn)行傳代，一般為5 x 105?cells/mL。如果低于這個(gè)濃度，細(xì)胞將需要很長(zhǎng)時(shí)間才能生長(zhǎng)，如果高于2 x 106?cells/mL，則可能會(huì)產(chǎn)生毒性。
●?在每次傳代之間，請(qǐng)不要使用離心機(jī)分離細(xì)胞。THP1細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的會(huì)更好，因此當(dāng)傳代時(shí)，不要棄去上一代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所使用的全部培養(yǎng)基，留1-2 mL，并加入新鮮的培養(yǎng)基。但是原來(lái)培養(yǎng)基的占比不能超過(guò)50%，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)去生長(zhǎng)。
為什么要在細(xì)胞傳代2-3次之后才可加入篩選抗生素？
由于最初的耐藥標(biāo)記物水平較低，細(xì)胞對(duì)篩選抗生素會(huì)更加敏感。因此，建議等待2 - 3代后再添加篩選抗生素，以避免在前幾代時(shí)對(duì)細(xì)胞造成進(jìn)一步的應(yīng)激。
建議用什么血清來(lái)培養(yǎng)InvivoGen的細(xì)胞?
建議使用無(wú)內(nèi)毒素的血清來(lái)培養(yǎng)報(bào)告細(xì)胞系。InvivoGen在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，會(huì)要求供應(yīng)商提供其所使用血清的COA，以確保低水平的內(nèi)毒素，以免激活NF-kB通路。
細(xì)胞培養(yǎng)基中應(yīng)添加多少濃度的青霉素或鏈霉素？
建議使用100 U/mL的青霉素和100 μg/mL鏈霉素。
如果用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中所含的L-glutamine（L-谷氨酰胺）濃度與說(shuō)明書(shū)中不一致會(huì)有問(wèn)題嗎？
沒(méi)有問(wèn)題的，只要培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的濃度不低于2 mM就可以。大多數(shù)DMEM配方中含有4mM的L-谷氨酰胺，但一般情況下培養(yǎng)基中含有2 mM的L-谷氨酰胺即可維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可以使用谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax嗎？
谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax均已通過(guò)測(cè)試，可以使用，在使用過(guò)程中與添加L-谷氨酰胺的細(xì)胞相比未發(fā)現(xiàn)有任何差異。
為什么推薦使用熱滅活的血清培養(yǎng)細(xì)胞？
許多InvivoGen的細(xì)胞系都是通過(guò)SEAP（分泌型胚胎堿性磷酸酶）報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行改造的。在很多情況下胎牛血清（FBS）中含有的微量堿性磷酸酶（AP）會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果。因此，為了降低背景干擾，建議使用滅活血清培養(yǎng)Invivogen的所有細(xì)胞。
有滅活胎牛血清（FBS）的操作方法嗎？
實(shí)驗(yàn)室中建議在56℃中加熱30分鐘來(lái)滅活血清。滅活時(shí)，需要等水浴溫度達(dá)到56℃之后再將含血清的試管放入，以確保血清完全滅活。
冷凍培養(yǎng)基必須含有滅活的胎牛血清（FBS）嗎？
實(shí)驗(yàn)時(shí)我們通常使用含滅活胎牛血清（FBS）的冷凍培養(yǎng)基，生長(zhǎng)培養(yǎng)基及測(cè)試培養(yǎng)基。然而，如果您在冷凍培養(yǎng)基中使用非滅活的血清也是沒(méi)有問(wèn)題的。
在培養(yǎng)HEK細(xì)胞時(shí)沒(méi)有貼壁，應(yīng)如何處理呢？
當(dāng)HEK-Blue?細(xì)胞沒(méi)有貼壁時(shí)，要么是開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)稀釋過(guò)度，要么是在培養(yǎng)瓶中融合過(guò)度窒息而死。
以下建議可使您在后續(xù)培養(yǎng)中避免出現(xiàn)這種問(wèn)題：
●?改變培養(yǎng)基，在T25培養(yǎng)基中以1.5×10^6 cells/mL培養(yǎng)細(xì)胞。
●?建議將細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶之前要清洗細(xì)胞。有時(shí)細(xì)胞難以貼壁是因?yàn)榛罴?xì)胞與死細(xì)胞聚集成簇。已因此清洗細(xì)胞以去除影響細(xì)胞貼壁的DMSO。
●?使用含20%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
●?CellBIND表面細(xì)胞培養(yǎng)瓶的使用會(huì)促進(jìn)細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)，然而，一般的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不需要使用表面細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
培養(yǎng)THP1細(xì)胞時(shí)細(xì)胞分裂一次需要一周的時(shí)間是正常的嗎？
細(xì)胞分裂一次需要一周的時(shí)間是不正常的。由于細(xì)胞克隆的不同，通常情況下THP1細(xì)胞分裂一次需要24-72個(gè)小時(shí)。培養(yǎng)THP1細(xì)胞時(shí)需保證細(xì)胞的濃度大于或等于5 x 105?cells/mL。Invivogen的研發(fā)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)注意到當(dāng)稀釋過(guò)度時(shí)會(huì)出現(xiàn)死亡。此外，在等待細(xì)胞改善的過(guò)程中不要添加Normocin?。
如果THP1細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)聚集成團(tuán)但未死亡應(yīng)該怎么辦呢？
只要細(xì)胞生長(zhǎng)很好，形態(tài)正常，細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)是沒(méi)有問(wèn)題的。因?yàn)樗兰?xì)胞的存在可能是導(dǎo)致細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)的原因，所以您可以離心去除死細(xì)胞。請(qǐng)注意，我們建議您在進(jìn)行化驗(yàn)前均質(zhì)細(xì)胞。
應(yīng)如何從活細(xì)胞中去除死細(xì)胞？
推薦使用120 G轉(zhuǎn)速離心10分鐘。
可以提供一些減少HEK-Blue?細(xì)胞背景信號(hào)的建議嗎?
●?為減少實(shí)驗(yàn)中的背景信號(hào)，需在刺激之前一直NF-kB的活性。
●?實(shí)驗(yàn)分析時(shí)使用至少傳代24小時(shí)的健康細(xì)胞。
●?確保細(xì)胞的匯合度不超過(guò)80%。
●?使用預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞。
●?使用滅活的胎牛血清（FBS）培養(yǎng)細(xì)胞（清除血清中殘留的堿性磷酸酶）。
●?進(jìn)行細(xì)胞刺激之前不要離心。
●?每個(gè)孔板中不要加入過(guò)多的細(xì)胞（推薦每孔中加入大概50000細(xì)胞）。
為什么在檢測(cè)培養(yǎng)基中不推薦加入NormocinTM？可以在檢測(cè)培養(yǎng)基中添加篩選抗生素嗎？
不建議在檢測(cè)培養(yǎng)基中添加NormocinTM是因?yàn)樵谶M(jìn)行檢測(cè)時(shí)要減少培養(yǎng)基中潛在的干擾因素。因此也不推薦在檢測(cè)培養(yǎng)基中添加其他篩選抗生素。
當(dāng)使用數(shù)量相同但傳代數(shù)不同的細(xì)胞及濃度相同的配體實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以得到類(lèi)似的結(jié)果嗎？
這很難說(shuō)，因?yàn)楹茈y預(yù)測(cè)傳代數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。但是在我們的實(shí)驗(yàn)中使用傳代數(shù)不同的細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是非常小的。
Invivogen的細(xì)胞系可以用于其它實(shí)驗(yàn)嗎？例如ELISA和Western blotting.
是的，Invivogen的細(xì)胞系是可以用于ELISA和Western Blots的。然而，我們沒(méi)有做過(guò)此類(lèi)驗(yàn)證。
Invivogen的細(xì)胞系可以用于定量檢測(cè)嗎？
它們是半定量測(cè)試。然而，它們可以通過(guò)使用陽(yáng)性對(duì)照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)用于定量測(cè)量。
是否可以將刺激后的上清液冷凍，以便日后讀取/檢測(cè)SEAP的產(chǎn)量?
如果您不能立即進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，可將上清樣本儲(chǔ)存于4℃，但儲(chǔ)存時(shí)間不可超過(guò)一周。如果需要更長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存，可將其置于-20℃。但在此條件下推薦使用含20%胎牛血清（FBS）的檢測(cè)培養(yǎng)基，以在冷凍過(guò)程中盡量保護(hù)SEAP不受損害，請(qǐng)不要重復(fù)凍融循環(huán)。
如果實(shí)驗(yàn)中需要使用抑制劑處理細(xì)胞，是用抑制劑單獨(dú)預(yù)處理細(xì)胞還是配體與抑制劑共孵育后處理細(xì)胞?
這由抑制劑所決定。如果抑制劑阻斷了信號(hào)通路中的受體或元素，我們建議將抑制劑與細(xì)胞預(yù)孵育至少30分鐘。如果抑制劑結(jié)合或阻斷配體(即針對(duì)特定細(xì)胞因子的抗體)，那么最好在添加到細(xì)胞之前將抑制劑與配體預(yù)孵育。
在刺激之前，細(xì)胞需要接種多長(zhǎng)時(shí)間？
在加入配體時(shí)應(yīng)同時(shí)接種細(xì)胞（先加配體）。
對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)該使用什么冷凍培養(yǎng)基？
對(duì)于貼壁細(xì)胞，推薦使用DMEM，20%(v/v)的胎牛血清（FBS）和10%(v/v)的DMSO。
對(duì)于懸浮細(xì)胞應(yīng)該是什么冷凍培養(yǎng)基？
對(duì)于懸浮細(xì)胞，推薦使用胎牛血清（FBS）和10%的DMSO。
如果凍存步驟未成功，應(yīng)如何處理？
以防出現(xiàn)類(lèi)似的問(wèn)題，Invivogen強(qiáng)烈建議在解凍凍存的細(xì)胞之前維持培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板中未凍存的細(xì)胞處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)。
SEAP的產(chǎn)生需要NF -κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子的激活，還是僅僅激活一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就可以得到信號(hào)?
Invivogen的報(bào)告細(xì)胞系僅需要激活一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（NFκB 和/或?AP-1）就可以得到信號(hào)。
Lucia?熒光素酶來(lái)自于什么物種?
InvivoGen的熒光素酶是完全合成的，不屬于任何天然熒光素酶。
更多詳情請(qǐng)聯(lián)系 InvivoGen 中國(guó)授權(quán)代理商欣博盛生物
全國(guó)服務(wù)熱線: 4006-800-892 ??????郵箱: market@neobioscience.com ??
深圳: 0755-26755892 ??????北京: 010-88594029 ????????
上海: 021-34613729 ????????廣州: 020-87615159??
代理品牌網(wǎng)站: www.yuebanme.com ??
自主品牌網(wǎng)站: www.neobioscience.net?