內(nèi)毒素，又稱脂多糖（LPS），是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要細(xì)胞壁成份。內(nèi)毒素的來源包括培養(yǎng)基、血清、水、緩沖溶液和其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑，如胰蛋白酶。內(nèi)毒素是體內(nèi)外炎癥反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑。內(nèi)毒素污染是細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)注射藥物中的主要問題。溶液和試劑可能是無菌但仍含有細(xì)菌成分，因此監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)試劑中是否存在內(nèi)毒素至關(guān)重要。
內(nèi)毒素的特點(diǎn)：
? 3 - 40 kDa：取決于O抗原的大小
? 兩親性：>1000 kDa 會(huì)在水溶液中形成聚集物
? 抗紫外線和熱穩(wěn)定性 （最高180°C）
? 多糖：大小因細(xì)菌種類而異。在人體誘導(dǎo)特異性抗原反應(yīng)。
? 脂質(zhì)A：具有LPS毒性。刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)。
內(nèi)毒素的污染源：
1.水
使用高純度水制備培養(yǎng)基和溶液，清潔玻璃器皿。
2.玻璃器皿
為了消除內(nèi)毒素，必須將玻璃器皿加熱至250°C（≥30分鐘），或加熱到180°C（3 小時(shí)）。
3.培養(yǎng)液、血清和添加劑
使用前要求制造商提供內(nèi)毒素水平認(rèn)證或測試。
4.塑料容器
要求制造商提供內(nèi)毒素水平和無致熱源的證明。
體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)
內(nèi)毒素在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均可引起不穩(wěn)定性。脂質(zhì)A能夠激活細(xì)胞表面或內(nèi)體的Toll樣受體4（TLR4），誘導(dǎo)MAP激酶（MAPK）及IRF（干擾素調(diào)節(jié)因子）通路的激活20, 21。盡管內(nèi)毒素的作用隨濃度和細(xì)胞類型的不同而改變，但它們確實(shí)可以改變細(xì)胞形態(tài)、影響增殖和轉(zhuǎn)染效率22。此外，LPS還誘導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子如TNF-α 、IL-1β 、IL-6 、IL-8 和 IL-18的產(chǎn)生，并激活 caspase 4/5/11-NLRP3 非經(jīng)典炎癥小體，最后導(dǎo)致細(xì)胞焦亡20, 23。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，低內(nèi)毒素濃度可刺激免疫系統(tǒng)，而高濃度可引起發(fā)燒、低血壓、多器官衰竭，甚至死亡22。
使用生物試劑檢測內(nèi)毒素
細(xì)胞比色分析法
HEK-Blue? LPS Detection Kit 2
??用途廣泛：適用于幾乎所有的生物試劑
??高靈敏度：檢測限為 0.01 EU/ml
? 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠：1個(gè)試劑盒最多可進(jìn)行500次測試
試劑盒依賴于InvivoGen專有的HEK-Blue?-4細(xì)胞，該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)人源TLR4和一個(gè)NF-κB誘導(dǎo)的分泌型胚胎堿性磷酸酶（SEAP）報(bào)告基因。簡單的實(shí)驗(yàn)程序使該試劑盒成為常規(guī)測試的理想選擇。只要樣品中含有微量的LPS，在與HEK-Blue?-4細(xì)胞孵育過夜后，會(huì)導(dǎo)致NF-κB的激活和SEAP報(bào)告基因的表達(dá)。培養(yǎng)上清液中的SEAP活性通過加上底物QUANTI-Blue?溶液，并使用分光光度計(jì)在620-655nm的波長測量。吸光度與內(nèi)毒素含量成正比。使用試劑盒中提供的HEK-Blue?內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)系列稀釋獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計(jì)算內(nèi)毒素濃度（大腸桿菌055:B5 LPS 的制備參照FDA批準(zhǔn)的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）制備標(biāo)準(zhǔn)）。HEK-Blue? LPS檢測試劑盒2也是InvivoGen內(nèi)部的常規(guī)內(nèi)毒素檢測方法。
LPS檢測試劑盒2的原理（見下圖）
使用此試劑盒的5大原因
1.替代昂貴而耗時(shí)的鱟試劑（LAL）。購買此套件一次，凍存HEK-Blue?-4細(xì)胞，以后只需重新訂購其他耗材。
2.與LAL分析不同，如果樣品含有（1,3）-β-D-葡聚糖，使用HEK-Blue?-4細(xì)胞進(jìn)行LPS檢測不會(huì)導(dǎo)致假陽性。
3.適用于所有生物樣品，包括培養(yǎng)基、血清、化學(xué)制劑和疫苗佐劑。
4.溶液顏色從粉紅色變?yōu)樽?藍(lán)色表示陽性反應(yīng)，結(jié)果簡單可視。
5.包括一本實(shí)驗(yàn)程序小冊子，計(jì)算內(nèi)毒素濃度的方法，以及疑難排解部分
相關(guān)文獻(xiàn)：
— Gray M. A. et al., 2020. Nat Chem Biol. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. DOI: 10.1038/s41589-020-0622-x.
— Imbert P. R. C. et al., 2021. Curr Biol. An Acquired and Endogenous?
Glycocalyx Forms a Bidirectional “Don’t Eat” and “Don’t Eat Me” Barrier to Phagocytosis. DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.082.
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產(chǎn)品名稱
| 產(chǎn)品說明 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
| HEK-Blue? LPS Detection Kit 2 | Assay for the detection and quantification of biologically active LPS | 1 kit | rep-lps2 |
| HEK-Blue? Selection | Antibiotics for maintenance of HEK-Blue? cells | 10 x 1 ml | hb-sel |
| HEK-Blue? Endotoxin Standard | Standardized E. coli 055:B5 LPS | 10 x 50 EU | rep-hbes-10 |
| QUANTI-Blue? Solution | Alkaline phophatase detection medium (liquid form, 100X)? | 5 ml 10 ml | rep-qbs rep-qbs2 |
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