酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種基于多孔板的技術(shù)，用于確定生物樣品中的抗體、抗原或其他蛋白質(zhì)的濃度，使用發(fā)色、熒光或發(fā)光的讀數(shù)。其基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。

自1971年開發(fā)以來，它已成為許多診斷和生物醫(yī)學研究實驗室的主力軍，在一系列應(yīng)用中表現(xiàn)出特異性、靈敏度和可重復(fù)性。常見的例子包括各種傳染病的檢測和妊娠試驗。

作為檢驗科常用的免疫學檢測方法之一，其操作簡單，無須特殊設(shè)備，使其在各級醫(yī)院都有應(yīng)用。但是，如果實驗中操作不規(guī)范，可能會造成假陰性或假陽性。因此，了解影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素對實驗是否成功是非常重要的。

1、選擇正確的檢測方法

根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點ELISA（Dot-ELISA）；再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為直接法、間接法、夾心法、競爭法等。

作為醫(yī)學和食品工業(yè)的診斷、監(jiān)測和質(zhì)量控制工具。酶聯(lián)免疫吸附試驗的檢測目標可以是抗原（例如，旨在檢測病毒的存在）或可以是抗體（例如，旨在檢測對抗原的免疫反應(yīng)）。

為簡單起見，下面的例子說明了抗原檢測，然而同樣的原理也適用于抗體檢測。

2.提前規(guī)劃

提前規(guī)劃可以幫助工作流程有效運行，并減少錯誤和重測的可能性；因此，有必要在工作流程開始前徹底規(guī)劃工作流程的所有組成部分。流程圖和檢測設(shè)計是重要的規(guī)劃考慮因素。需要確定的因素包括：待測樣品的數(shù)量、復(fù)測次數(shù)和所需的試劑平板/試劑盒的數(shù)量。

3.樣品處理和稀釋

試劑和樣品處理不當或儲存不正確會影響下游分析，因為不同的緩沖劑和試劑會有不同的儲存要求。例如，有些必須儲存在冰箱里，有些在室溫下，有些用感光罩（如鋁箔）。

如果有計劃在未來的實驗中使用相同的樣品，那么應(yīng)該把它們放入等分試樣中，需要時再取出來。這將避免多次冷凍/解凍循環(huán)，保持準確的結(jié)果。當樣品準備使用時，應(yīng)在冰上解凍（或根據(jù)方案）。

4.確保一致性和準確性

獲得一致和準確結(jié)果的方法之一是確保實驗臺被適當?shù)卦O(shè)置，使所有的組件和儀器都觸手可及。使用經(jīng)過校準的精密移液器也將限制移液過程中的任何不一致。

運行內(nèi)精密度是指各孔之間的誤差。如前所述，加入重復(fù)樣本對識別錯誤和異常情況很重要。變異系數(shù)（CV）是一個描述群體內(nèi)變異性的比率，與觀察值的絕對值無關(guān)。當解釋ELISA的數(shù)據(jù)時，%CV對于識別樣品復(fù)制中的任何不一致是很有用的。這表現(xiàn)在測定后的光密度（OD）值之間的變化。總之，%CV越低，結(jié)果越精確。

檢測間的精確性是指板間或檢測間的重復(fù)性，如在不同的日子完成的檢測。盡管商業(yè)化的ELISA試劑盒有測定間質(zhì)量控制，但科學家們必須保留一個詳細的筆記本，記錄在方案中任何時候的變化，以便其他研究人員能夠以同樣的方式完成同樣的實驗，獲得同樣的結(jié)果。這也使得檢測能夠隨著時間的推移進行監(jiān)測，以確定任何系統(tǒng)性問題或檢測性能的下降。

5.避免污染

污染會在ELISA數(shù)據(jù)的下游分析中造成許多問題，如孔與孔之間的高差異、高背景值和弱或低信號強度。有幾種方法可以防止污染：

5.1 在一個干凈的環(huán)境中工作；

5.2 通過去離子或蒸餾對所有的水進行消毒；

5.3 每次轉(zhuǎn)移時使用新的和干凈的試劑；

5.4 在兩個樣品之間使用新的移液器吸頭；

5.5 準備和應(yīng)用樣品時要小心，避免濺到或交叉污染；

5.6 如果使用自動化，確保系統(tǒng)被清潔，試劑供應(yīng)經(jīng)常更新；

5.7 只去除試劑需要的部分，避免將其倒回庫存瓶中，因為這可能會引入污染物。

6.正確的洗板技術(shù)

正確的洗滌和沖洗方案尤其重要。在下游分析過程中，不充分、不一致和/或過度清洗會造成問題。有許多洗板的方法，包括使用自動洗板機、手動分流器或洗瓶。當手動吸出孔中的液體時，要注意不要碰到孔的底部--吸管的尖端應(yīng)該放在孔的一側(cè)。為了減少背景信號，清洗量需要足夠大，以去除孔中未結(jié)合的樣品和試劑。然而，過度洗滌會減少目標信號。

確保所有的孔都被平均清洗，以避免在整個檢測板上引入信號變化。要做到這一點，如果是手工清洗，請檢查移液器吸頭是否固定好，如果使用自動洗板機，所有分配和吸液的噴頭必須沒有堵塞。你可以在空板上測試它們，以檢查它們是否同樣工作。

7.數(shù)據(jù)歸一化

準確的數(shù)據(jù)分析是ELISA工作流程中非常重要的一步，它解決了測定間的變異性問題，這可能受到許多因素的影響，如溫度和發(fā)育。為了限制這些因素對檢測結(jié)果的影響，應(yīng)在實驗之間通過比較每個板上的標準品來進行歸一化。

8.保持在動態(tài)范圍內(nèi)

至關(guān)重要的是，檢測樣品要保持在板式讀數(shù)器的動態(tài)范圍內(nèi)，否則結(jié)果將不具代表性，儀器的動態(tài)范圍可以在機器手冊中找到。在開發(fā)檢測方法和確定樣品稀釋度時，最高和最低的陽性樣品都應(yīng)落在儀器的動態(tài)范圍內(nèi)。標準品通常與ELISA試劑盒一起提供；然而，這些也可以獨立采購。

希望ELISA實驗人員在操作過程中遵循上面的提示，以確保實驗產(chǎn)生準確和可靠的結(jié)果。

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