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CleanAmp? dNTP應用:24min完成三重qPCR

2021-04-28
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試劑:CleanAmp? PCR Kit

儀器:Mastercycler? ep realplex4?S qPCR instrument

分子診斷需求的不斷增長(如新冠核酸檢測),要求所用檢測試劑、設備能在更短的時間內提供準確的、可重復的檢測結果。這種需求下,多重實時PCRMultiplex qPCR)是一項很有用的技術,可省時、省力、省樣本,還能降低成本。然而盡管多重qPCR檢測技術有著諸多優(yōu)點,但實際應用時卻需要進行很多的優(yōu)化來避免由于引物組增加而造成的擴增效率下降的問題。TrilinkCleanAmp? dNTP試劑完美的解決了這一問題,本文展示了使用TrilinkCleanAmp? dNTP試劑和靈敏的qPCR儀器實現快速三重qPCR的案例


CleanAmp? dNTPTrilink運用自己專業(yè)的核酸修飾技術開發(fā)的專利產品。


PCR的熱啟動,通常要通過使用熱啟動酶來實現。而PCR實驗中,簡單的將標準dNTP替換為CleanAmp? dNTP即可獲得與使用昂貴的熱啟動酶相同的優(yōu)勢。CleanAmp? dNTP是經過修飾的核苷三磷酸,該修飾可以在反應初期阻止核苷酸摻入直至dNTP被熱激活,如此可極大地減少錯誤引發(fā),避免引物二聚體形成以及其他可能的不良影響,從而在多重和快速PCR實驗中具有非常好的性能。CleanAmp? PCR Kit試劑盒中提供CleanAmp? dNTP,包括已成功驗證過的DNA聚合酶。該試劑盒可以靈活地用于多種PCR檢測,包括快速和多重PCR。


Eppendorf realplex4?S?real-time PCR系統(tǒng)使用超快的珀爾帖(Peltier熱循環(huán)模塊,以6°C /秒的速度加熱并以4°C /秒的速度冷卻,在一小時內即可完成標準的40循環(huán)qPCR反應。珀爾帖模塊還可以確保溫度控制的精確性以及較高的模塊均質性,這對于高質量PCR反應至關重要。該系統(tǒng)的光學模塊是一個由96LED 組成的陣列,這些LED可以預先選擇均衡,以使它們可以均勻激發(fā)所有樣本孔。這種設置消除使用其他常規(guī)qPCR儀器時,需要用ROX作為校正染料的必要性Realplex4?S使用了光電倍增管(PMT)進行信號檢測,這是目前可用的最靈敏,最經濟的檢測技術。


為了進一步探索CleanAmp? PCR試劑盒和Eppendorf realplex4?S?real-time PCR系統(tǒng)的優(yōu)勢,本文的研究以這兩種技術的結合為特色,在30分鐘內完成可重復性的實時三重PCR的檢測。

方法


使用CleanAmp?dNTP試劑盒與水解探針在realplex4?S?real-time PCR系統(tǒng)進行實時三重PCR檢測。使用CleanAmp? PCR試劑盒擴增了三個小鼠基因組DNA靶標,分別為125、185214個堿基對。實驗分兩組進行:首先,分別使用標準和快速PCR對三個靶標同時進行三重擴增(圖1)。其次,使用快速PCR對三個靶標進行同時擴增和單個擴增(圖2)。所有反應均帶有Master clear?蓋條的Eppendorf實時PCR管條通過使用水解探針進行檢測:125 bp6-JOE; 0.2 μM),185 bpFAM; 0.05 μM)和214 bpROX; 0.2 μM)。


? ?CleanAmp? dNTP應用:24min完成三重qPCRCleanAmp? dNTP應用:24min完成三重qPCR


首先,對標準和快速循環(huán)流程下的三重qPCR實驗進行了評估。所有反應均設置一式四份,并使用小鼠基因組DNA5倍系列稀釋液為樣本,范圍從320 pg1.0 μg。標準熱循環(huán)qPCR實驗的方案按照CleanAmp? PCR試劑盒產品說明書中的多重PCR方案1X PCR緩沖液(10 mM Tris-HClpH 8.3),50 mM KCl2.5 mM MgCl2),0.4 mM CleanAmp? dNTP,0.01 U / μL Taq DNA聚合酶和0.2 μM引物,25 μL)。在快速多重PCR實驗方案在上述方案的基礎上進行了以下改變:70 mM KCl,4.0 mM MgCl20.6 mM CleanAmp? dNTP,0.33 U /μL U?Taq DNA聚合酶,引物(125 bp185 bp組為0.5 μM,214 bp引物組為0.7 μM,15 μL)。


其次,在快速循環(huán)條件下進一步評估CleanAmp? dNTP試劑盒,分別以單重和多重反應擴增三個相同的靶標。依然使用小鼠基因組DNA5倍系列稀釋液為樣本,范圍從320 pg200 ng,并設置三重復??焖傺h(huán)條件和熱循環(huán)條件按照如上所述方案進行。對于單重反應,遵循CleanAmp? PCR Kit產品說明書中的快速熱循環(huán)方案1x PCR緩沖液(10 mM Tris-HClpH 8.3),50 mM KCl4.0 mM MgCl2),0.4 mM CleanAmp ? dNTPs,0.33 U / μL Taq DNA聚合酶和0.5 μM引物,15 μL體系)。

結果與結論


對比標準和快速兩個條件下的三重?qPCR的結果顯示:兩者分別1 h 26 min24 min的熱循環(huán)時間內得到穩(wěn)定的數據。在兩種反應條件下,擴增曲線間隔良好,重復緊密。R2顯示標準曲線符合良好的線性,且不同靶標、不同檢測的擴增效率相當(Figure.1)同樣在快速循環(huán)條件下分別進行的單指標和三重指標的擴增結果也類似:對于每個靶濃度,單指標和三重指標的擴增曲線重合,如圖2所示。因此,每個反應相似的Cq反應了不同反應的擴增效率的一致性,如表(2B)所示。這些發(fā)現展示CleanAmp? PCR試劑盒的多功能性和Mastercycler? ep realplex4 qPCR儀的速度,兩者相互補充,僅在24分鐘內就能獲得高效、可重復的三重qPCR數據。


CleanAmp? PCR試劑盒和Mastercycler? ep realplex4 S qPCR儀的組合使我們能夠在保持標準PCR單指標PCR可得到的高擴增效率的同時,實現快速三重qPCR.




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