細(xì)胞因子是一種分子量較小的蛋白質(zhì)，可促進(jìn)免疫細(xì)胞之間的信號傳遞，協(xié)調(diào)對感染病原體和腫瘤發(fā)生的反應(yīng)以及整體免疫穩(wěn)態(tài)，吸引各種免疫相關(guān)疾病的臨床前和臨床研究人員將其作為研究對象。它們在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，基于細(xì)胞因子的治療方法展示了免疫療法的新發(fā)展。然而，制約細(xì)胞因子的療效的因素有其在血液循環(huán)中短的半衰期、多向性和不利的生物分布。目前一些創(chuàng)新的細(xì)胞因子工程技術(shù)有助于應(yīng)對這些制約因素，但通常無法用于基礎(chǔ)研究的方向。

所以AdipoGen適時推出InVivoKines系列重組蛋白，該系列是新一代重組融合蛋白，用于免疫治療、臨床前和體內(nèi)轉(zhuǎn)化研究。InVivoKines系列蛋白是基于Fc的融合蛋白，采用KIH（Knobs-into-Holes）技術(shù)開發(fā)。

InVivoKines系列產(chǎn)品特點(diǎn)

? 具有天然構(gòu)象——由HEK 293或CHO細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生

? 無動物源成分條件下生產(chǎn)

? 通過ELISA和基于細(xì)胞的分析測試具有高生物活性

? 通過SEC驗(yàn)證純度和同質(zhì)性

? 低內(nèi)毒素水平

? 批次間一致性高

KIH（Knobs-into-Holes）技術(shù)生產(chǎn)InVivoKines系列Fc融合蛋白簡介

KIH（Knobs-into-Holes）概念是Ridgway等人在1996年提出的一種開創(chuàng)性的設(shè)計思路，允許重鏈異二聚化，產(chǎn)生“具有兩條不同臂的IgG”，通常用于設(shè)計在藥物開發(fā)中起重要作用的雙特異性抗體。它允許通過操縱參與Fc二聚體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基來產(chǎn)生互補(bǔ)的相互作用界面。具有較小側(cè)鏈的氨基酸被具有較大側(cè)鏈的氨基酸取代，從而在一條鏈上產(chǎn)生一個突起，反之則在伴侶鏈上產(chǎn)生一個孔。傳統(tǒng)上，一個CH3結(jié)構(gòu)域中的T366Y突變被用于產(chǎn)生一個突起，而另一個CH3結(jié)構(gòu)域中的Y407T突變產(chǎn)生一個孔。這種突變建立了分子間相互作用，并由于突起和孔配對而促進(jìn)異二聚體的形成。由于分子固有的復(fù)雜性，高純度KIH雙特異性生物蛋白的生產(chǎn)具有一定困難。KIH的有效共表達(dá)依賴于突起和孔的等量表達(dá)。

Adipogen的Fc-KIH技術(shù)允許Fc異二聚化產(chǎn)生具有兩個不同臂的結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生天然存在的活性單體、異二聚體或同二聚體蛋白質(zhì)。擁有Fc-KIH結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞因子可延長細(xì)胞因子的血漿半衰期，從而在保持活性的同時顯著改善藥代動力學(xué)（PK）。延長半衰期原理在于IgG/Fc結(jié)構(gòu)域（IgG）和新生FcR（FcRn）的結(jié)合可以保護(hù)抗體和Fc融合蛋白不被降解，從而延長血清中的半衰期。在酸性條件下（pH6.0-6.5），F(xiàn)cRn與IgG結(jié)合，在中性和弱堿性條件下（pH7.0-7.5）發(fā)生解離。內(nèi)皮細(xì)胞通過攝取IgG形成酸化的內(nèi)體而形成內(nèi)吞小泡，IgG與FcRn結(jié)合形成IgGs-FcRn復(fù)合物。IgG-FcRn復(fù)合物通過再循環(huán)的內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。在pH7.4等生理條件下，IgG-FcRn復(fù)合物解離，IgG再次釋放到血液循環(huán)中。通過這種受體介導(dǎo)的再循環(huán)機(jī)制，F(xiàn)cRn有效地保護(hù)IgG免受溶酶體降解，從而延長了IgG的半衰期。Knobs-into-Holes（KIH）-Fc結(jié)構(gòu)域顯示出與標(biāo)準(zhǔn)Fc融合結(jié)構(gòu)域或抗體IgG相似的特性，可參考文獻(xiàn)：The Role of Fc Receptors on the Effectiveness of Therapeutic Monoclonal Antibodies: P. Gogesch, et al.; Int. J. Mol. Sci. 22, 8947 (2021)

Fc-KIH結(jié)構(gòu)域與Fcγ受體（FcγRs）和補(bǔ)體C1q結(jié)合，可能導(dǎo)致ADCC、ADCP和CDC效應(yīng)。Fc-KIH的LALA-PG突變會抑制其與FcγRs和C1q的結(jié)合，而FcRn結(jié)合和Fc穩(wěn)定性不受影響。具有Fc-KIH結(jié)構(gòu)的蛋白是在內(nèi)毒素含量很低的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生。Fc-KIH蛋白不僅能用于體內(nèi)研究，也適用于體外實(shí)驗(yàn)。

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圖1.AdipoGen Life Sciences利用KIH技術(shù)開發(fā)單體、異二聚體或同二聚體Fc融合蛋白示意圖。

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基于IgG的效應(yīng)功能介紹

基于IgG抗體和Fc融合蛋白是臨床前和治療應(yīng)用中開發(fā)的生物蛋白類產(chǎn)品。它們與免疫系統(tǒng)的交流由Fcγ受體（FcγRs）控制和介導(dǎo)，F(xiàn)cγRs是一種膜結(jié)合蛋白。這類生物蛋白類產(chǎn)品包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，具有特異性和親和力以及具有可以與免疫細(xì)胞表面以及血液中的補(bǔ)體（C1q）和FcRn表達(dá)的Fc受體（FcγRI、FcγRII、FcγRIII）結(jié)合的Fc片段，從而激活免疫效應(yīng)。Fc結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的效應(yīng)功能包括抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP）和補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性（CDC），所有這些都是通過Fc結(jié)構(gòu)域與不同細(xì)胞類型上的Fc受體的相互作用介導(dǎo)的。

ADCC:效應(yīng)細(xì)胞上的FcRs與靶細(xì)胞上生物蛋白的Fc區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致溶解酶的分泌和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)分子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞溶解。

ADCP:吞噬細(xì)胞上的FcRs與靶細(xì)胞或免疫復(fù)合物上的生物蛋白的Fc區(qū)結(jié)合，通過吞噬作用促進(jìn)清除。

CDC: C1q與靶細(xì)胞上生物蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合，觸發(fā)補(bǔ)體級聯(lián)和膜攻擊復(fù)合物（MAC）的組裝，導(dǎo)致細(xì)胞溶解。

圖3. IgG1抗體或Fc融合蛋白的作用機(jī)制由直接效應(yīng)和間接效應(yīng)組成，包括抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（ADCP）和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）示意圖。

InVivoKines系列重組蛋白產(chǎn)品列表

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