硫黃素T (Thioflavin T) 是一種熒光染料，可以和富含β折疊的結(jié)構(gòu)結(jié)合，例如α-突觸核蛋白纖維原、Tau纖維原等。一旦結(jié)合，硫黃素T的發(fā)射光譜就會(huì)發(fā)生紅移 ，并且熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)，這是一個(gè)很好的用來(lái)檢測(cè)纖維原形成的測(cè)試。以下操作指南是用α-突觸核蛋白前體纖維原和單體做的硫黃素T檢測(cè)。
1.用蒸餾水制備 1mM 硫黃素T儲(chǔ)備溶液 (新鮮制備并使用 0.2μm 注射器過(guò)濾器過(guò)濾)。
2.用PBS pH 7.4稀釋硫黃素T，確保每個(gè)孔中的硫黃素T最終濃度為 25 μM (每孔溶液體積= 100 μL). 孔板: Lumox 96 多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024).
3.在將要使用之前才把a(bǔ)lpha突觸核蛋白小份在室溫下解凍。
4.在相應(yīng)的孔中加入 10 nM 前體纖維原或者100 μM 單體 (或兩者都有). 用移液器將孔中液體上下吸入排出混合. 濃度為估計(jì)值，需要優(yōu)化來(lái)得到好的信號(hào)，并避免浪費(fèi).
5.密封孔板然后置于震蕩孵育器中 (600 rpm)，37°C孵育.
6.用 Molecular Devices Gemini XPS 微孔板讀板機(jī)讀取熒光讀數(shù)，使用軟件是 Softmax Pro 版本為 6.5.1.
XPS 酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù):
? 溫度: 37°C
? 讀取形式: 孔板掃描
? 波長(zhǎng): 激發(fā)光 450 nm，發(fā)射光 485 nm
? PMT 增益: 自動(dòng)
? 閃光每讀: 6
? 震蕩: 讀數(shù)前20 秒
7.再次密封孔板置于震蕩孵育器下 37°C.
8.1 到 72 小時(shí)常規(guī)區(qū)間讀數(shù).
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