Funakoshi LipiDye II是一款適用于長時間活細胞成像以觀察動態(tài)脂滴（LDS）合成、移動或降解的綠色熒光染料；是LipiDye（貨號：FDV-0010）的升級版，同時具備超強的光穩(wěn)定性和高靈敏度等特點。
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??產品信息
| 貨號 | FVD-0027 |
規(guī)格 | 0.1mg |
化學式 | C26H17NO2S2 |
分子大小 | 439.5 g/mol |
溶解性 | 溶于DMSO |
熒光特性 | Ex. 400-500 nm（maximum ~420 nm） 與藍色激發(fā)激光器（如405、445、458、473和488 nm*激光器等）、氙燈或帶有商用FITC或GFP濾光片的LED兼容； 注：488 nm可激發(fā)LipiDye II，但與473 nm激發(fā)相比熒光較弱。 如果使用488 nm激光，請根據(jù)實驗經驗優(yōu)化成像條件，如染料濃度等。 Em. 450-650 nm（取決于溶劑） 如豆油的最大值~510nm，與LD相似。建議在490-550 nm范圍內使用。 |
??產品特點
? 可檢測非脂肪細胞中直徑?
???適用于長時間活細胞成像，具有超強的光穩(wěn)定性。
???適用脂滴分解與合成。
???適用于脂肪細胞分化過程，時間可長達8天。
???適用于活細胞、固定處理的細胞以及活細胞染色后再固定細胞染色。
???推薦使用濃度為0.1~1 μM，對細胞幾乎無毒性。
???可對細胞脂滴進行半定量分析。
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●?脂滴與LipiDye II
脂滴（Lipid droplets，LDs）是一種具有獨特的單層磷脂，可儲存甘油三酯和甾醇酯等中性脂質的細胞器（圖1）。LDs普遍存在于脂肪細胞中，具有儲存能量和脂質運輸?shù)墓δ?。研究發(fā)現(xiàn)，LDs不僅存在于脂肪細胞，還存在肝細胞和神經膠質細胞等其他非脂肪細胞中，明確LDs具有調節(jié)代謝以及保護鄰近細胞免受脂質毒性的功能。LDs的數(shù)量大小以及組成因細胞類型的不同而不同。例如，脂肪細胞中LDs的直徑?>?10μm，可通過光學顯微鏡觀察到；而非脂肪細胞中LDs的直徑在0.1μm~1μm（圖2）。因此，實現(xiàn)可以檢測出活細胞中非脂肪細胞的微小LDs的動態(tài)運動及功能將是一個重要突破。
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傳統(tǒng)的LDs熒光染料（如尼羅河紅）僅限于檢測脂肪細胞或經過量脂質處理的細胞中相對較大的LDs；在活細胞條件下無法實現(xiàn)檢測存在于非脂肪細胞的微小LDs。Funakoshi的LipiDye（貨號：FDV-0010）可檢測1μm大小的LDs，雖然其具備高靈敏度和高選擇性，但LipiDye需要405?nm的激發(fā)波長，光穩(wěn)定性不足，不適合用于長期活細胞成像以觀察動態(tài)LDs的合成、移動或降解。
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因此，F(xiàn)unakoshi又推出了LipiDye的升級版—LipiDye II，可被毒性較低的450-480 nm激發(fā)，并具有超強的光穩(wěn)定性；同時適用于長時間活細胞成像，包括短期多時間激發(fā)的Z-stack延時成像。
圖1 脂滴的結構與組成
圖2?脂滴在脂肪細胞和非脂肪細胞的直徑大小
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●?活細胞成像的一般步驟
1、在無血清、無酚紅的培養(yǎng)基中配制1 μM的LipiDye II；
（注：LipiDye II可與含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基兼容，但需優(yōu)化FBS和LipiDye II的濃度；推薦濃度0.1 μM用~405 nm激發(fā)，濃度1μM用~473 nm激發(fā)；根據(jù)實驗經驗優(yōu)化并確定LipiDye II的濃度）
2、去除培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞數(shù)次；
3、向細胞中加入含LipiDye II的培養(yǎng)基；
4、37℃孵育30分鐘以上（注：根據(jù)實驗經驗優(yōu)化孵育時間）；
5、使用PBS或培養(yǎng)基清洗細胞并加入新鮮培養(yǎng)基（可選）；
6、觀察細胞。
??參考數(shù)據(jù)
●?LipiDye II的光譜
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圖A：LipiDye II的吸收光譜幾乎不受溶劑影響，可觀察LipiDye II在400?nm~500?nm的吸收。
圖B：LipiDye II在不同溶劑中有不同的發(fā)射光譜。如在甲苯和二氯甲烷等低極性溶劑中，它發(fā)出的熒光從藍色到綠色，量子產率高；另一方面，在高極性溶劑（乙腈、二甲基亞砜和水）中，LipiDye II則表現(xiàn)出弱熒光強度和紅移熒光。
圖C：用LipiDye II對細胞染色，在熒光顯微鏡下約500?nm處觀察細胞中LDs的發(fā)射光譜。
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●?LipiDye II的光穩(wěn)定性
分別使用 LipiDye II（紅）、舊版LipiDye（藍）和傳統(tǒng)LD?dye B（灰）對提前固定在4%?甲醛中的3T3-L1脂肪細胞進行染色；然后用共聚焦顯微鏡（Ex.?473 nm/Em 490-540 nm）反復采集同一區(qū)域脂肪細胞的Z-stack成像，觀察熒光強度的變化。傳統(tǒng)染料B的熒光強度在5次Z-stack成像后，熒光強度顯著降低；舊版LipiDye在經過50次Z-stack成像后，其熒光強度則逐漸降低約60%。而LipiDye II 即使經過50次（共500次光照射），其熒光強度幾乎沒有任何變化。證明LipiDye II非常適用于長時間的延時成像，具有超強的光穩(wěn)定性。
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●?LipiDye II的細胞毒性
使用不同濃度的LipiDye II培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞24小時。隨后用MTT法評估細胞活力。結果顯示LipiDye II
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●?活細胞和PFA固定細胞染色
使用LipiDye II染色在活細胞狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細胞，進行活細胞成像。然后用4%?PFA固定3T3-L1脂肪細胞，再次進行熒光觀察（Ex. nm/Em 490-540 nm）。細胞在固定前后的熒光強度幾乎沒有任何變化，證明LipiDye II可用于活細胞染色，也可用于活細胞成像后的任何免疫細胞化學實驗。
LipiDye?染色的活細胞和經PFA固定后的熒光強度的對比
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??應用數(shù)據(jù)
●?LipiDye II在不同細胞中的染色
使用LipiDye II（1μM）分別對3T3-L1、HepG2、COS-7和HeLa細胞染色12小時，隨后在熒光顯微鏡下觀察（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm；比例尺：20μm）。在HepG2細胞染色前一天，使用棕櫚酸（0.33 mM）/油酸（0.66 mM）處理誘導脂滴形成；HeLa細胞中，可清晰觀察到約1 μm的微小LDs（比例尺：5μm）。
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●?內質網(wǎng)（ER）標記的多色成像
用LipiDye II（1 μM）對表達ER駐留熒光蛋白（mKO1）的COS7細胞染色12小時。然后使用共聚焦顯微鏡觀察COS7細胞（LipiDye II：Ex. 473 nm/Em 490-540 nm；mKO1：?Ex. 635 nm/Em 660-710 nm）。在ER的網(wǎng)絡結構中可以觀察到?< 1 μm的微小LDs。(比例尺：20 μm、5 μm和1 μm)
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●?LipiDye II在脂肪細胞分化和成熟過程中的長時間染色
使用含LipiDye II（1μM）的培養(yǎng)基誘導3T3-L1前脂肪細胞分化為3T3-L1成熟脂肪細胞。含LipiDye II的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)前脂肪細胞2天后，每隔2天用含LipiDye II的維持培養(yǎng)基，在共聚焦激光顯微鏡下觀察8天。結果證明，LipiDye II可以對活細胞進行長時間處理，觀察脂滴的成熟過程。整個分化過程中沒有出現(xiàn)對細胞的毒性作用，同時也沒有影響細胞的分化。
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●?脂肪生成的Z-stack成像
使用含LipiDye II（1μM）的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞24小時，并進行Z-stack成像。分化約10小時后，通過共聚焦顯微鏡（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）觀察到有微小的LDs生成（650分鐘，白色箭頭）；同時可觀察到各脂滴在相互作用，逐漸變大的動態(tài)（1050~1450分鐘，黃色箭頭）。
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●?脂肪分解的Z-stack成像
將3T3-L1脂肪細胞和LipiDye II（1μM）共同孵育，然后用腺苷酸環(huán)化酶激活劑（Forskolin，10 μM）和磷酸二酯酶抑制劑IBMX（100 nM）處理細胞來增加脂肪細胞內cAMP的濃度，從而促進三酰甘油的水解。
添加Forskolin和IBMX后，立即使用共聚焦顯微鏡（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）進行Z-stack成像（持續(xù)800分鐘，共3000幅圖像）。兩小時后，觀察到許多微小LDs形成(比例尺：5 μm)。
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●?STED 超分辨率顯微成像微小脂滴
用LipiDye II（1μM）對HeLa細胞進行染色。通過激光共聚焦顯微鏡（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）和STED超高分辨率顯微鏡（Ex.473 nm/ Em?500-640 nm、STED 660 nm）觀察微小脂滴。STED 成像可檢測到半峰全寬（FWHM）約120?nm的微小脂滴，而共聚焦顯微鏡無法清晰檢測。（關于STED顯微鏡的觀察條件及分析方法，請見參考文獻）
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●?利用熒光酶標儀對細胞脂滴進行半定量分析
首先將三種細胞株（人腎癌細胞786-O、小鼠腦神經瘤細胞Neuro-2a和中國倉鼠卵巢細胞CHO）分別以1 x 104個細胞/孔的數(shù)量接種到96孔板中，并在含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)24小時，再用10~200 μM 油酸處理細胞24小時，以促進脂滴的生長。然后用含有2% FBS/DMEM 的5 μM LipiDye II染色2小時。PBS沖洗細胞兩次，用熒光酶標儀測量熒光強度（Ex 420 ±5 nm/Em 503 ±10 nm）。結果顯示在這三種細胞中觀察到脂滴對油酸具有劑量依賴性。
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??參考文獻
1. Taki et al.,ACS. Mater. Lett.., 3, 42-49 (2021), Fused Thiophene-S,S,-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets
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