我的樣本可以用于CUT&RUN嗎?? 四大因素需考量

CUT&RUN技術(shù)使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞核來繪制組蛋白翻譯后修飾（PTMs）和染色質(zhì)相關(guān)蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）的全基因組富集圖譜。在EpiCypher，客戶經(jīng)常會問，“我的細(xì)胞樣本適用于CUT&RUN技術(shù)嗎? ”盡管大家希望所有細(xì)胞都可以表現(xiàn)出理想的適用性，但事實(shí)并非如此。

在這里，我們將討論EpiCypher在評估CUT&RUN實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞使用的主要標(biāo)準(zhǔn)。通常情況下，不理想的樣本質(zhì)量=不理想的CUT&RUN數(shù)據(jù)。

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1.細(xì)胞數(shù)量

為了獲得可靠精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，EpiCypher建議在CUT&RUN實(shí)驗(yàn)中每個反應(yīng)使用500,000個細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們分兩次對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)：第一次是在最初的細(xì)胞采集時，第二次是將細(xì)胞固定在磁珠上之前。第二次計(jì)數(shù)的目的是確保在使用CUT&RUN緩沖液洗滌過程中沒有大量細(xì)胞樣本的丟失或細(xì)胞裂解的發(fā)生。有關(guān)具體指導(dǎo)信息，請點(diǎn)擊技術(shù)支持中心了解詳情。

CUTANA? CUT&RUN成功將選定的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)減少到5000個。需要注意的是，使用較低的細(xì)胞數(shù)可能會降低CUT&RUN產(chǎn)量，所以需要據(jù)此對文庫制備和測序進(jìn)行調(diào)整。如果出現(xiàn)這些情況，請點(diǎn)擊CUT&RUN Library Prep Kit手冊以獲得實(shí)用建議。

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2.細(xì)胞活力

EpiCypher在細(xì)胞收獲時就會測定細(xì)胞活力或“活細(xì)胞”的百分比。初始細(xì)胞的活力對于CUT&RUN實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。低活力可能導(dǎo)致分析背景增加、產(chǎn)量降低以及在實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞/磁珠出現(xiàn)聚集的問題。

值得注意的是，細(xì)胞的最佳活力高度依賴于樣本類型。例如，用于CUT&RUN實(shí)驗(yàn)的K562細(xì)胞我們要求在培養(yǎng)收獲時有>90%的活力。然而，對于其他某些樣品類型或?qū)嶒?yàn)條件，細(xì)胞的最佳活力可能較低。

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關(guān)于細(xì)胞活力和細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的小提示

EpiCypher建議使用簡單的臺盼藍(lán)染色方法來計(jì)數(shù)細(xì)胞并確定初始細(xì)胞活力。因?yàn)榕_盼藍(lán)染料對細(xì)胞有毒，所以在添加染料后一定要立即計(jì)數(shù)。

有些細(xì)胞對臺盼藍(lán)高度敏感。如果細(xì)胞在臺盼藍(lán)染色時顯示出較低的活力，但在培養(yǎng)過程中具有預(yù)期的形態(tài)、最小的裂解度且能正常生長，那么這些細(xì)胞可能適用于CUT&RUN技術(shù)。對此，我們建議使用濃度更低的臺盼藍(lán)染料或嘗試其他細(xì)胞計(jì)數(shù)方法（如碘化丙啶）來確認(rèn)細(xì)胞活力。

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3.細(xì)胞形態(tài)和完整性

CUT&RUN技術(shù)需要形態(tài)正常的完整細(xì)胞。形態(tài)是指細(xì)胞形狀，與組織來源和/或細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長方式有關(guān)。懸浮細(xì)胞，如K562細(xì)胞，通常來源于血細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞，具有圓形和對稱的形態(tài)。由于貼壁細(xì)胞可以來源于上皮、內(nèi)皮、神經(jīng)元或成纖維細(xì)胞組織，因此表現(xiàn)出不同的形態(tài)和擴(kuò)增特征。例如，上皮細(xì)胞往往具有均勻的細(xì)胞形狀，可以在細(xì)胞培養(yǎng)板上成片生長，而成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出不對稱、細(xì)長的形態(tài)，可用于研究細(xì)胞遷移。

使用裂解或質(zhì)量差的細(xì)胞也會導(dǎo)致數(shù)據(jù)質(zhì)量低。為了確保有效的樣品制備，EpiCypher在初始細(xì)胞采集和磁珠結(jié)合之前均會檢查細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜的完整性。第二次檢查很重要，因?yàn)橐恍悠奉愋停ɡ鏔ACS分離的細(xì)胞或來自組織的細(xì)胞）可能對CUT&RUN洗滌緩沖液中的裂解成分更敏感。在這些情況下，我們建議在進(jìn)行CUT&RUN實(shí)驗(yàn)時分離細(xì)胞核（Figure 1）。

Figure 1: Successful isolated K562 cell nuclei. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

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4.細(xì)胞來源注意事項(xiàng)：細(xì)胞系、原代細(xì)胞、組織和干細(xì)胞

細(xì)胞的形態(tài)、活力和數(shù)量會直接受到細(xì)胞來源的影響。CUT&RUN實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞可以來自組織、細(xì)胞系、培養(yǎng)的原代細(xì)胞或通過其他方式純化的細(xì)胞（例如FACS）。下面我們將討論這些細(xì)胞樣本的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)。

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√ 永生化細(xì)胞系

示例：HEK293、HeLa、K562、NIH/3T3、MCF-7（Figure 2）、H1299（Figure 3）、A549和THP-1細(xì)胞系。

優(yōu)點(diǎn)：一般來說，細(xì)胞系是CUT&RUN技術(shù)中最容易優(yōu)化的input。細(xì)胞系可以提供：

● 大量具有高活力的細(xì)胞——CUT&RUN實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

●?精準(zhǔn)且可高度重復(fù)的CUT&RUN實(shí)驗(yàn)結(jié)果——源于細(xì)胞系的同質(zhì)性。

●?用于藥物篩選、基因過表達(dá)/抑制等的強(qiáng)大系統(tǒng)——不會破壞樣本質(zhì)量。

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缺點(diǎn)：細(xì)胞系的使用有很多注意事項(xiàng)，概述如下。而根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞系可能是最佳的來源選擇。

●?一般來說，細(xì)胞系不能代表體內(nèi)條件。它們通常來源于腫瘤細(xì)胞或其他病變細(xì)胞群，與原代細(xì)胞相比，它們的功能可能不同。

●?細(xì)胞系容易發(fā)生基因組改變，包括染色體異常、重復(fù)和/或遺傳漂移。

●?被其他細(xì)胞系污染很常見。錯誤細(xì)胞系的鑒定結(jié)果可能會妨礙測定的重現(xiàn)性，并導(dǎo)致錯誤的生物學(xué)結(jié)論。

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Figure 2: MCF-7 breast cancer cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

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√?原代細(xì)胞

示例：來源于活體組織樣品，固體（如腸、肺、肝、皮膚）或液體（如血液），經(jīng)過或未經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)的均可。?

優(yōu)點(diǎn)：原代細(xì)胞經(jīng)常用于CUT&RUN，因?yàn)檠芯空呤褂盟鼈兛梢裕?/span>

●?探究在天然異質(zhì)的細(xì)胞環(huán)境中染色質(zhì)的功能和生物學(xué)機(jī)制。

●?研究通過FACS或其他技術(shù)分離的稀有細(xì)胞的功能狀態(tài)。

●?確定細(xì)胞對體內(nèi)刺激或藥物治療的反應(yīng)。

●?表征患者樣本（例如腫瘤VS.健康細(xì)胞）。

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缺點(diǎn)：原代細(xì)胞的缺點(diǎn)取決于研究的組織和細(xì)胞類型。在研究原代細(xì)胞時，可能面臨的挑戰(zhàn)有：

●?分離足夠數(shù)量的細(xì)胞——在分離過程中細(xì)胞的敏感性（如FACS）或在組織中的低豐度。

●?獲得具有高活力的細(xì)胞——原代細(xì)胞通常需要小心處理以防發(fā)生裂解。

●?擴(kuò)大培養(yǎng)——原代細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長能力通常僅限于幾個階段，需要仔細(xì)規(guī)劃并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時間表。

●?獲得一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果——特別是來源于含有許多不同細(xì)胞類型的大塊組織。

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Figure 3: H1299 non-small cell lung carcinoma cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

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√?干細(xì)胞

示例：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：生長和培養(yǎng)多能干細(xì)胞群和成體干細(xì)胞群的功能使以下研究成為可能：

●?研究細(xì)胞發(fā)育、分化和疾病發(fā)展過程中的表觀遺傳學(xué)變化。

●?生成用于功能分析和治療開發(fā)的稀有細(xì)胞類型。

●?開發(fā)用于個性化醫(yī)療應(yīng)用的患者特異性細(xì)胞群。

●?使用二維細(xì)胞和/或類器官培養(yǎng)研究細(xì)胞的生長和分化。

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缺點(diǎn)：盡管干細(xì)胞在細(xì)胞和基因治療研究以及發(fā)育生物學(xué)方面有前景，但干細(xì)胞的研究在許多方面都面臨挑戰(zhàn)：

●?干細(xì)胞培養(yǎng)需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，即便如此，擴(kuò)增某些干細(xì)胞群也很困難。

●?培養(yǎng)干細(xì)胞需要多種質(zhì)控措施和精確的監(jiān)測，成本高且耗時。

●?不同研究人員之間的分化方案可能會有所不同，從而引入意想不到的偏差和變化。

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關(guān)于EpiCypher公司：

EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學(xué)公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold?開始，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)導(dǎo)者。利用其獨(dú)有技術(shù)，不斷增加產(chǎn)品庫中高純度修飾重組核小體（dNucs?）產(chǎn)品。dNuc?多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。

EpiCypher還將dNuc?技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測定產(chǎn)品中，包括：SNAP-ChIP?Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne^?底物（用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)），dCyher?測定（用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA?分析。

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