如何選擇核小體(nucleosomes)?

作者：Ellen N. Weinzapfel 博士，Lu Sun 博士

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染色質(zhì)及其調(diào)控在包括癌癥等多種人類疾病中都發(fā)揮重要作用，并共同構(gòu)成了學(xué)術(shù)、工業(yè)和臨床研究中快速發(fā)展的研究領(lǐng)域1。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本亞單位是核小體，由大約147bp的DNA纏繞在核心組蛋白八聚體上構(gòu)成（圖1）2。組蛋白亞基有多種化學(xué)修飾，如甲基化、乙?；土姿峄@些修飾被稱為組蛋白修飾或翻譯后修飾(PTMs)。

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組蛋白修飾的功能:一種組蛋白編碼

這些修飾調(diào)節(jié)染色質(zhì)對各種蛋白質(zhì)的可及性，如轉(zhuǎn)錄因子和核小體重塑復(fù)合物3,4。此外，組蛋白PTMs可以直接與染色質(zhì)相互作用或招募染色質(zhì)相互作用蛋白。因此，不同的組蛋白修飾與獨(dú)特的基因組功能相關(guān)。例如，組蛋白H3賴氨酸27（H3K27me3）上的三甲基化與基因抑制密切相關(guān)5，而H3K4me3定位于活性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，因此與基因激活相關(guān)6。

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總之，這些組蛋白修飾網(wǎng)絡(luò)及其動態(tài)調(diào)控協(xié)調(diào)了硬編碼基因組的表觀遺傳控制，從而影響各種細(xì)胞過程，如基因調(diào)控、細(xì)胞分化和發(fā)育4,7。

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研究組蛋白修飾的理想底物

越來越多的證據(jù)表明，核小體是體外表征許多染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的最佳底物。這與之前的研究不同，之前的研究通常使用修飾的組蛋白肽來識別染色質(zhì)抑制劑或定義新的組蛋白PTM相互作用。

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在之前一篇關(guān)于組蛋白肽和核小體用于組蛋白PTM抗體驗證的博客文章(https://www.epicypher.com/resources/blog/histone-peptides-vs-nucleosomes-which-is-better-for-chip-antibody-validation/)中，我們已經(jīng)討論了這個主題。然而，這些問題也與染色質(zhì)修飾酶的研究有關(guān)。例如，NSD2甲基轉(zhuǎn)移酶(與多發(fā)性骨髓瘤中的致癌重編程相關(guān))需要核小體底物才能發(fā)揮體外活性8。同樣，當(dāng)使用重組核小體時，通過SETD8甲基轉(zhuǎn)移酶的Km顯示SAM輔因子比使用組蛋白肽底物時降低了10000倍9。

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隨著攜帶完全確定組蛋白修飾的重組核小體的出現(xiàn)，為下一代染色質(zhì)研究提供了新的或更好的方法(如染色質(zhì)結(jié)合蛋白分析、酶分析、抗體譜分析)。

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如何獲得重組核小體?

獲得重組核小體的制造工藝有很多種，如EpiCypher通過設(shè)計來獲得核小體(EpiCypher designer nucleosomes, dNucs)。一般來說，大部分相關(guān)的方法基本遵循相同的一系列步驟:

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然而，并非所有的重組核小體都具有相同的質(zhì)量！不同供應(yīng)商的合成過程和質(zhì)量驗證標(biāo)準(zhǔn)可能存在很大差異。

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如何挑選優(yōu)質(zhì)的核小體？

如果您要使用重組核小體進(jìn)行染色質(zhì)實(shí)驗，則需考慮以下幾點(diǎn)：

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1、用于開發(fā)修飾組蛋白的方法。確保使用無疤痕方法整合所需的PTMs是很重要的，這種方法可以重現(xiàn)天然組蛋白結(jié)構(gòu)。EpiCypher 使用幾種不同的方法獲得修飾的組蛋白，所有方法都會無疤痕整合組蛋白修飾。

為什么這很重要呢？許多市售的重組核小體是使用組蛋白PTM類似物構(gòu)建的，如甲基賴氨酸類似物(MLAs) 10，其會導(dǎo)致修飾位點(diǎn)的氨基酸序列發(fā)生變化。這些非天然組蛋白修飾類似物已被證明會破壞與染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白和組蛋白PTM特異性抗體的相互作用，并且這對研究生理機(jī)制來講是不理想的。因此，使用這些方法合成的核小體時應(yīng)格外謹(jǐn)慎11-13。

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2、修飾組蛋白的純度。組裝完全定義的同質(zhì)核小體的下一步是對修飾組蛋白進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

在質(zhì)控結(jié)果中，HPLC 跡線應(yīng)顯示是單一洗脫物質(zhì)，表明組蛋白純度>95%；平行高分辨率質(zhì)譜（HRMS）應(yīng)在預(yù)期質(zhì)量的1道爾頓范圍內(nèi)顯示一個單峰，沒有任何意義的額外電荷質(zhì)量（m/z）信號（例如圖2A）。EpiCypher的所有修飾組蛋白均通過HPLC和HRMS分析進(jìn)行驗證。

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為什么這很重要呢？不必要的物質(zhì)（如甲硫氨酸氧化）可能引起結(jié)構(gòu)改變，并影響靜電相互作用或疏水相互作用，從而損害下游核小體組裝的效率。

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3、組裝核小體的質(zhì)量控制(QC)指標(biāo)。DNA組裝后核小體的質(zhì)量驗證對最終產(chǎn)品的信任保證至關(guān)重要。

EpiCypher使用天然PAGE分析DNA上的dNuc組裝，其中使用約150bp DNA的高效組裝應(yīng)該只產(chǎn)生單一物質(zhì)，這相對于未組裝的游離DNA，其遷移率降低(圖2B，下圖)。

為什么這很重要呢？因為被污染的游離DNA會誘導(dǎo)染色質(zhì)修飾酶(如NSD2)的異常活性，所以必須避免。此外，次優(yōu)組裝可能導(dǎo)致樣品的異質(zhì)性混合，包括錯誤定位的核小體。

我們還使用考馬斯染色對最終的dNucs進(jìn)行SDS-PAGE分析，以確保四種組蛋白的化學(xué)計量相等（圖2C，下圖）。然后，我們通過免疫印跡證實(shí)了整合組蛋白PTM的存在（圖2C，上圖）。

為什么這很重要呢？如果其他種類的蛋白質(zhì)污染或偏離1:1:1:1的比例，則可能表明組蛋白降解或組裝不良，因此有必要重新解析每個組蛋白。而免疫印跡對于確定修飾是否存在于組蛋白的正確位置上非常重要。

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EpiCypher擁有令人印象深刻的產(chǎn)品目錄，其中包括83個獨(dú)特的重組核小體庫存，并且有能力生產(chǎn)定制設(shè)計核小體，質(zhì)量高、周期短，助力您的研究！

想了解更多關(guān)于EpiCypher重組核小體技術(shù)和產(chǎn)品的信息嗎？請聯(lián)系欣博盛！

EpiCypher核小體相關(guān)產(chǎn)品系列?

◆?Recombinant Nucleosomes

◆?SNAP-ChIP??Spike-ins

◆?SNAP-CUTANA? Spike-in Controls

◆?Modified Designer Nucleosomes (dNucs?)

◆?dCypher? Nucleosome Panels

◆?EpiDyne??Chromatin Remodeling Substrates

◆?Recombinant Nucleosomes (rNucs)

◆?Mutant Nucleosomes

◆?Purified Nucleosomes (HeLa, Avian)

◆?Nucleosome Components and Subunits

◆?Variant Nucleosomes (vNucs)

◆?Methyl DNA Designer Nucleosomes

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參考文獻(xiàn)

1. Valencia AM, Kadoch C.?Chromatin regulatory mechanisms and therapeutic opportunities in cancer.?Nat Cell Biol, 2019. p.?(PubMed PMID: 30602726)

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EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學(xué)公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold?開始，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)導(dǎo)者。利用其獨(dú)有技術(shù)，不斷增加產(chǎn)品庫中高純度修飾重組核小體（dNucs?）產(chǎn)品。dNuc?多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。

EpiCypher還將dNuc?技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測定產(chǎn)品中，包括：SNAP-ChIP?Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne?底物（用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)），dCyher?測定（用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA?分析。

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