該免疫沉淀實(shí)驗(yàn)方法僅供參考，由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的試劑不同，并且涉及不同的物種，組織類型及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟和改良。
所需試劑
細(xì)胞準(zhǔn)備:
?Tris 緩沖鹽溶液（TBS）. 使用 10x TBS, pH 7.5 (1.0M Tris HCl, 1.5M NaCl). 用適量去離子水稀釋到 可在室溫下保存一個(gè)月 .
?裂解緩沖液. 含有0% 合適洗滌劑的TBS、1mg/ml的 牛血清白蛋白 BSA、合適的蛋白質(zhì)酶抑制劑.
?稀釋緩沖液. 與裂解緩沖液相同, 除去蛋白質(zhì)酶抑制劑.
?用于裂解物預(yù)處理的瓊脂糖軛合物. 預(yù)吸收裂解物以移除與一抗二抗的非特異結(jié)合. 用來(lái)自同一物種的瓊脂糖標(biāo)準(zhǔn) IgG做一抗, 抗宿主的二抗. 用稀釋緩沖液1:1制備懸浮液.
一抗:
?一抗的對(duì)照. 對(duì)于多抗血清, 使用來(lái)自同一物種的未免疫的血清. 單克隆抗體使用相同亞型和純度.
?免疫沉淀的瓊脂糖軛合物. 使用抗一抗宿主的瓊脂糖二抗. 用稀釋緩沖液1:1制備懸浮液.
?Tris 緩沖液. 制備05M 的Tris 緩沖液, pH 6.8.
?2x SDS-PAGE 樣品緩沖液
?2-巰基乙醇
實(shí)驗(yàn)步驟
1.將5 x 107 細(xì)胞置于裂解緩沖液中, 在冰上孵育30-60 分鐘制備裂解液.
2.渦旋裂解液后置于離心機(jī)上250 x g離心10分鐘, 除去細(xì)胞核留下上清液.
3.將上清液于100,000 x g離心30分鐘, 或者微型離心機(jī)10,000 x g 離心30分鐘, 再取上清液.
4.加入瓊脂糖軛合物來(lái)預(yù)處理裂解液以除去非特異的蛋白結(jié)合. 每200 μl 裂解液使用10μl 對(duì)照瓊脂糖. 于4oC下震蕩1小時(shí). 200 x g離心. 留上清液.
5.向兩個(gè)微離心管中各加入 200 μl 含有抗原的預(yù)處理了的裂解液. 用稀釋緩沖液將體積補(bǔ)至 1 ml.
6.向一個(gè)離心管中加入一抗. 對(duì)于多克隆抗血清或腹水加入5-5 μl一抗. 對(duì)組織培養(yǎng)上清液加入 10-100 μl一抗. 向第二個(gè)離心管加入同等體積的一抗對(duì)照. 冰上孵育1小時(shí).
7.做免疫沉淀時(shí)每個(gè)管加入50μl瓊脂糖軛合物. 4oC下輕微震蕩1小時(shí).
8.于200 x g離心1分鐘或微型離心機(jī)離心5秒鐘. 用移液管小心移出上清液. 用1 ml 稀釋緩沖液輕緩重新懸浮底部團(tuán)塊. 重復(fù)洗滌. 先用TBS洗滌最后用5 M Tris, pH 6.8洗滌.
9.如上所示再次離心. 加入20-50 μl 樣品緩沖液. 混合后在100 oC加熱5分鐘. 稍微微離心一下, 將上清液直接用于非還原性電泳SDS-PAGE. 如果需用還原性條件, 將上清液轉(zhuǎn)移到新管中加入5% 2-巰基乙醇. 如上混合加熱.
10.電泳蛋白質(zhì)混合物. 染色凝膠或免疫印跡 (使用我們 Western Blot 的實(shí)驗(yàn)方案) 顯色. 顯現(xiàn)的條帶包括抗原的多肽鏈和使用的抗體.
* 怎樣選擇正確的珠子:
物種免疫球蛋白亞型Protein AProtein G
人 IgG1? 結(jié)合力強(qiáng)? ? ? ? 結(jié)合力強(qiáng)
人 IgG2? 結(jié)合力強(qiáng)? ? ? ? 結(jié)合力強(qiáng)
人 IgG3? 沒(méi)有結(jié)合力? ? ? 結(jié)合力強(qiáng)
人 IgG4? 結(jié)合力強(qiáng)? ? ? ? 結(jié)合力強(qiáng)
人 IgM? 使用抗 人 IgM
人 IgE? 沒(méi)有結(jié)合力? ? ? 結(jié)合力弱
人 IgA? 沒(méi)有結(jié)合力? ? ? 結(jié)合力弱
小鼠 IgG1? 結(jié)合力弱? ? ? ? 結(jié)合力強(qiáng)
小鼠 IgG2a? 結(jié)合力強(qiáng)? ? ? ? 結(jié)合力強(qiáng)
小鼠 IgG2b? 結(jié)合力中等? ? ?結(jié)合力中等
小鼠 IgG3? ?結(jié)合力弱? ? ? ? 結(jié)合力弱
小鼠 IgM? ?使用抗小鼠 IgM
大鼠 IgG? ? 沒(méi)有結(jié)合力? ? 結(jié)合力弱
大鼠 IgG2a? ? 沒(méi)有結(jié)合力? ? 結(jié)合力強(qiáng)
大鼠 IgG2b? ? 沒(méi)有結(jié)合力? ? 結(jié)合力中等
大鼠 IgG2c? ? 結(jié)合力弱? ? ? ? 結(jié)合力中等
雞的 所有亞型? 沒(méi)有結(jié)合力? ?沒(méi)有結(jié)合力
牛的所有亞型結(jié)合力中等? ?結(jié)合力強(qiáng)
山羊的所有亞型沒(méi)有結(jié)合力? ?結(jié)合力中等
豚鼠所有亞型結(jié)合力強(qiáng)? ?結(jié)合力中等
倉(cāng)鼠所有亞型結(jié)合力弱? ?結(jié)合力中等
馬的所有亞型結(jié)合力弱? ?結(jié)合力強(qiáng)
豬的所有亞型結(jié)合力弱? ?結(jié)合力中等
兔的所有亞型結(jié)合力強(qiáng)? ?結(jié)合力中等
綿羊的所有亞型沒(méi)有結(jié)合力? ?結(jié)合力強(qiáng)
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