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觸發(fā)天然免疫和自噬的線粒體DNA

2021-05-17
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線粒體是獨(dú)特的哺乳動(dòng)物細(xì)胞器,以細(xì)胞的能量工廠著稱,普遍認(rèn)為是由需氧菌進(jìn)化而成。線粒體在細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡中扮演重要角色。越來(lái)越多的研究表明,線粒體在天然免疫中有核心作用,并可能促成炎癥疾病。在感染和應(yīng)激之后,受損的線粒體釋放其組分,包括線粒體?DNA(mtDNA),后者是一種強(qiáng)效的損傷相關(guān)分子模式(DAMP),可通過(guò)多種模式識(shí)別受體(PRRs)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。參與識(shí)別mtDNA的主要幾種PRRs是:Toll-like receptor 9 (TLR9),Nod-likereceptor family,pyrin domain containing 3 (NLRP3)和 cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)。


線粒體DNA類似于細(xì)菌DNA,因其包含非甲基化CpG二核苷酸重復(fù)序列,后者可被小胞體受體TLR9識(shí)別。一些研究表明,由于受損而釋放在胞漿循環(huán)中的mtDNA可直接活化TLR9,從而活化NF-kB,產(chǎn)生促炎性因子如TNF-a和IL-61-3。用TLR9抑制性O(shè)DNs1,2或敲除Tlr9基因4,被證實(shí)可削弱炎癥反應(yīng),因此證實(shí)TLR9參與mtDNA的識(shí)別。


另外一個(gè)炎癥通路,是mtDNA引發(fā)形成NLRP3炎癥小體。最近發(fā)表的數(shù)據(jù)提示,釋放在胞漿中的mtDNA可活化NLRP3炎癥小體,導(dǎo)致caspase-1依賴的促炎性細(xì)胞因子IL-1b和IL-18的分泌。去除mtDNA可有效抑制IL-1b和IL-18的分泌,即使細(xì)胞被炎癥小體誘導(dǎo)劑刺激5。此外,氧化的mtDNA被證實(shí)可直接結(jié)合并活化NLRP36。


線粒體DNA也可活化cGAS-STING啟動(dòng)產(chǎn)生1型干擾素(IFNs)而觸發(fā)炎性反應(yīng)。最近的文獻(xiàn)表明,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中釋放到胞漿的mtDNA可活化cGAS,產(chǎn)生cGAMP,后者招募STING,下游進(jìn)一步活化TBK1-IRF3信號(hào)通路,產(chǎn)生1型干擾素7,8。另有最新研究表明,皰疹病毒感染引起細(xì)胞應(yīng)激而產(chǎn)生的mtDNA也可活化cGAS-STING信號(hào)通路9。


mtDNA觸發(fā)的炎癥反應(yīng)與自噬密切相關(guān)。自噬是一種關(guān)鍵的適應(yīng)機(jī)制,多余的胞漿成份(如DNA,蛋白,線粒體和細(xì)胞內(nèi)病原)被雙膜泡 (自噬體)“沒(méi)收”,后者與溶酶體融合,降解其中捕獲的胞漿組分,達(dá)到清除效果,從而保護(hù)細(xì)胞避免應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。另外,自噬可通過(guò)調(diào)節(jié)如NF-kB10和STING11等關(guān)鍵免疫調(diào)控器來(lái)限制過(guò)激的炎癥反應(yīng)。在如微生物感染和重大創(chuàng)傷的病理狀態(tài)下,功能失調(diào)的線粒體和受損mtDNA在胞漿中積累至超出自噬降解能力時(shí),自噬的負(fù)向調(diào)節(jié)功能隨之喪失。結(jié)果導(dǎo)致炎癥反應(yīng)大幅提升,常伴有慢性炎癥的發(fā)生,后者由于TLR92,12,NLRP35和(或)cGAS-STING13應(yīng)答異常而引起。mtDNA在線粒體相關(guān)疾病,包括感染疾病,自身免疫病和癌癥中的作用機(jī)制,還有待于更進(jìn)一步的研究來(lái)解析。


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自噬報(bào)告基因細(xì)胞

自噬通過(guò)溶酶體將包漿物質(zhì)降解,是維持恒定程序的基本要素。這一多步驟程序包括將物質(zhì)分離入泡膜,形成自噬體,與溶酶體融合,降解和再循環(huán)內(nèi)容物。研究自噬潮(autophagic flux)的關(guān)鍵蛋白是LC3(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)。在分離膜形成時(shí),胞漿中的LC3被招募并進(jìn)入自噬程序,此定位動(dòng)作被視為自噬膜的特征,用以檢測(cè)自噬的生成和發(fā)展。由LC3B融合一個(gè)綠色銀光蛋白(GFP)和一個(gè)紅色熒光蛋白(RFP)組成的嵌合蛋白,是檢測(cè)自噬進(jìn)程的簡(jiǎn)單方法。自噬體形成可被RFP-GFP-LC3標(biāo)記,顯示RFP和GFP雙信號(hào)。與溶酶體融合后,酸性環(huán)境可顯著降低GFP信號(hào),RFP信號(hào)卻保持穩(wěn)定。


HeLa-DiFluo? hLC3 Cells
RAW-DiFluo? mLC3 Cells
THP1-DiFluo? hLC3 Cells

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自噬報(bào)告基因細(xì)胞HeLa-Difluo?hLC3細(xì)胞,RAW-Difluo?mLC3細(xì)胞和THP1-Difluo?hLC3細(xì)胞分別源于人上皮瘤細(xì)胞系HeLa,鼠源巨噬細(xì)胞系RAW264.7和人源單核細(xì)胞系THP-1。這些報(bào)告基因細(xì)胞全部穩(wěn)定表達(dá)RFP::GFP::LC3融合蛋白(RFP-GFP-LC3):人源或鼠源LC3的N末端融合兩個(gè)熒光報(bào)告蛋白,RFP(酸性穩(wěn)定)和GFP(酸性敏感)。在這些報(bào)告基因細(xì)胞中,通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)綠色GFP-LC3和(或)紅色RFP-LC3斑點(diǎn)的呈現(xiàn)狀態(tài),實(shí)現(xiàn)RFP-GFP搭配實(shí)時(shí)檢測(cè)自噬潮的功能。在自噬早期,RFP和GFP信號(hào)皆可被探知,當(dāng)進(jìn)入自噬體與溶酶體融合程序,GFP熒光信號(hào)消失,只留下可視的RFP熒光信號(hào)。GFP-LC3/RFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞和RFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞的比例可用來(lái)評(píng)估自噬潮的階段,這一方法已被報(bào)道1,2。


HeLa-Difluo? hLC3 cells,RAW-Difluo? mLC3 cells和THP1-Difluo? hLC3 cells對(duì)Zeocin?有抗性。


1. Loos B. et al. 2014. Defining and measuring autophagosome flux- concept and reality. Autophagy. 2014;10(11):2087-96.

2. Kimura S. et al., 2007. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent tagged LC

3. Autophagy. 3(5):452-60.


HeLa-Difluo?hLC3細(xì)胞被25μM rapamycin 單獨(dú)處理或25μM rapamycin和 500nM bafilomycin A1(抑制自噬體和溶酶體融合)聯(lián)合處理。孵育24小時(shí),用2% PFA固定細(xì)胞,并用共聚焦顯微鏡分析結(jié)果。請(qǐng)注意在圖片viii中,黃色(自噬體)和紅色(自噬溶酶體)斑點(diǎn)均顯著提升,而圖片ix中的斑點(diǎn)幾乎均為黃色(自噬體)。


自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑

自噬是原生分解程序,由細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激物(營(yíng)養(yǎng)物和能量貧乏)引起。自噬由生成自噬體開始,這一步驟由一系列蛋白調(diào)控,包括VPS34的III型磷脂酰肌醇(PI)3激酶復(fù)合體,隨后與溶酶體的融合將自噬體酸化。自噬的阻斷有多種方式,例如III型PI3激酶抑制劑可通過(guò)抑制自噬捕獲動(dòng)作而阻斷自噬進(jìn)程,或者用抑制溶酶體酸化的抑制劑阻止自噬溶酶體的形成和自噬降解。自噬進(jìn)程是被縝密調(diào)控的。mTORC1,一種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子敏感的激酶,是自噬的主要阻遏器。因此,mTORC1及其信號(hào)通路的抑制劑可誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬。


原代細(xì)胞培養(yǎng)的抗菌劑

Primocin?

原代細(xì)胞培養(yǎng),始終要面對(duì)來(lái)源于原代器官(如,皮膚或腸道樣本)或周遭環(huán)境中(如實(shí)驗(yàn)室,儀器,實(shí)驗(yàn)人員等)微生物毀滅性污染的威脅。為了保護(hù)您的原代細(xì)胞免受污染,InvivoGen開發(fā)出一種獨(dú)家專利廣譜抗生素,Primocin?。


產(chǎn)品描述
Primocin?通過(guò)阻斷微生物DNA和蛋白合成從而去除支原體,細(xì)菌和真菌。Primocin?的作用靶點(diǎn)僅存在于微生物中,包括三個(gè)細(xì)菌靶點(diǎn)(DNA旋轉(zhuǎn)酶,原核生物核糖體亞單位30S和50S)和一個(gè)真菌靶點(diǎn)(麥角固醇,一種僅在真菌和酵母細(xì)胞膜發(fā)現(xiàn)的分子)。由于特殊的“雞尾酒”抗生素設(shè)計(jì),Primocin?對(duì)于某些廣泛存在于實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌(如Pseudomonas aeruginosa,Listeria monocytogenes和Bacillus species)甚至比InvivoGen自主研發(fā)的Normocin?處理效果更好。更為重要的是,Primocin?對(duì)原代細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性,這要?dú)w功于其抗真菌劑成分與Amphotericin B比,無(wú)毒性且更加穩(wěn)定。


應(yīng)用及功效
Primocin?在原代細(xì)胞分離,培養(yǎng)的文獻(xiàn)中高頻引用。例如,在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中分離原代人源自然殺傷(NK)細(xì)胞的亞克隆1;從鼠胚胎腦組織中分離星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞2。另外,最近的研究證明Primocin?處理干細(xì)胞污染的功效,如脆性X綜合癥中人源胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)3。在Wang et al.等設(shè)計(jì)的長(zhǎng)期培養(yǎng)人源多能干細(xì)胞(hPSCs)方案中,使用Primocin?配合InvivoGen抗支原體制劑Plasmocin?來(lái)預(yù)防細(xì)菌和支原體污染,被視為成功分選和培養(yǎng)的“關(guān)鍵步驟”4。有些科研團(tuán)隊(duì)將Primocin?應(yīng)用于先端生物學(xué)領(lǐng)域:3D細(xì)胞培養(yǎng)和生物人工臟器。例如,Graham et al. 在研究鼠源生物人工結(jié)腸中研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)而產(chǎn)生炎癥和凋亡過(guò)程,將Primocin?加入鼠源生物人工結(jié)腸培養(yǎng)基,以預(yù)防污染5。 類似的研究還有,Weeber和同事用Primocin?確保從結(jié)腸直腸癌(CRC)分離的轉(zhuǎn)移活檢癌類器官可以正常增殖6。Nichols et al.在從原代成年人肺細(xì)胞和兒童肺支架建立肺類器官時(shí)兩次使用Primocin?:處理肺源組織,以及培樣分離的肺器官和氣管、支氣管細(xì)胞7。
雖然Primocin?與其它抗生素完美兼容,但其最大的優(yōu)點(diǎn)是使用Primocin?時(shí),無(wú)需添加其它抗生素。在原代細(xì)胞培養(yǎng)中,Primocin?可以處理其它抗生素?zé)o法殺死的微生物,消除威脅,無(wú)疑是您的最佳選擇。例如,最近Cao & Poss在關(guān)于斑馬魚心臟外植體培養(yǎng)的文章中指出,Primocin?可降低最初幾天心外膜細(xì)胞污染的幾率,然而青霉素/鏈霉素(Pen/Strep)和 Fungizone?(Amphotericin B)的組合并不能避免污染8。
Primocin?也可用于保護(hù)無(wú)限增殖化細(xì)胞系。比如,Pastrana et al.用Primocin?處理293TT,ART,SFT和A549,以確保隨后BK多瘤病毒的感染篩選實(shí)驗(yàn)不受干擾9。
全世界的研究者都信賴Primocin?保護(hù)原代細(xì)胞不受支原體,細(xì)菌和真菌入侵的功效。也請(qǐng)同時(shí)關(guān)注InvivoGen其它廣譜抗菌劑(請(qǐng)查看相關(guān)產(chǎn)品)。

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