酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法（Enzyme-Linked ImmunoSpot, EILSpot）是在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞分泌物的一種高靈敏度的檢測(cè)方法。

圖一
1.固定特異性單克隆抗體在96孔ELISpot板上。
2.分別加入有特異性刺激因子和無(wú)刺激因子的細(xì)胞。
3.孵育過(guò)程中，細(xì)胞被刺激因子激活開(kāi)始分泌細(xì)胞因子，細(xì)胞因子和單克隆抗體結(jié)合。
4.移除細(xì)胞，加入交聯(lián)生物素或酶的檢測(cè)單克隆抗體。
5.如果使用交聯(lián)生物素的單克隆抗體檢測(cè)，加入鏈霉親和素酶聯(lián)物。
6.最后，加入底物，細(xì)胞分泌位點(diǎn)會(huì)形成有色斑點(diǎn)。
7.計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組斑點(diǎn)數(shù)量。



ELISpot是迄今為止細(xì)胞分析最敏感的方法之一，它以細(xì)胞因子為分析對(duì)象，比傳統(tǒng)的ELISA方法敏感20-200倍。ELISpot和RT-PCR敏感性相當(dāng)，不同的是ELISpot檢測(cè)的是分泌蛋白而不是mRNA。 ELISpot分析細(xì)胞因子有很大優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞因子分泌后可立即被連接到捕獲抗體上，因此很少會(huì)被結(jié)合蛋白和活性蛋白酶破壞。ELISpot具有較高的靈敏性，特別適用于細(xì)胞因子含量較低時(shí)的檢測(cè)，例如特異性免疫反應(yīng)的定期檢測(cè)等。

應(yīng)用
ELISpot分析方法被廣泛應(yīng)用于感染引起的特異性免疫反應(yīng)、癌癥、過(guò)敏、自身免疫疾病。它是研發(fā)和檢測(cè)新疫苗和候選疫苗的標(biāo)準(zhǔn)方法。ELISpot通過(guò)細(xì)胞因子分析也能用來(lái)鑒別T細(xì)胞的亞型，例如，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2 和TNF-α，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5 和 IL-13。ELISpot既可以進(jìn)行單個(gè)實(shí)驗(yàn)也能進(jìn)行大規(guī)模試驗(yàn)。和四聚體法（檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)）相比，進(jìn)行大規(guī)模試驗(yàn)時(shí)ELISpot不許需要提前表位鑒定和MHC-Ⅰ型限制。對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求比較低，適合于實(shí)地研究。隨后，以ELISpot為平臺(tái)的診斷測(cè)試也相繼出現(xiàn)，它通過(guò)檢測(cè)結(jié)核桿菌抗原刺激T細(xì)胞后的分泌物IFN-γ判斷病人是否感染結(jié)核或攜帶者。ELISpot比皮膚測(cè)試有更高的靈敏性和特異性，不會(huì)混淆之前接種的BGC疫苗。ELISpot可以應(yīng)用于許多物種，除了人、猴子、小鼠、大鼠細(xì)胞之外，還可應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)，評(píng)價(jià)牛、羊、馬、豬來(lái)源的T細(xì)胞反應(yīng)。

疫苗開(kāi)發(fā)
IFN-γ ELISpot被應(yīng)用于許多大規(guī)模試驗(yàn)用于監(jiān)測(cè)HIV候選疫苗，評(píng)價(jià)HIV疫苗和其它病原體及腫瘤疫苗（見(jiàn)圖2）。ELISpot還可檢測(cè)疫苗的功效，從而評(píng)估疫苗的設(shè)計(jì)方法是否合適。除了可以檢測(cè)IFN-γ，ELISpot還可檢測(cè)其它細(xì)胞毒性關(guān)鍵因子，例如：穿孔蛋白、顆粒酶B。

圖2.肽刺激T細(xì)胞后用ELISpot分析人IFN-γ。CD8+ T用來(lái)源于病毒的MHC-Ⅰ型限制肽刺激16小時(shí)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（不刺激）。


過(guò)敏反應(yīng)
ELISpot可應(yīng)用于過(guò)敏研究，過(guò)敏研究中的Th2反應(yīng)至關(guān)重要，但是反應(yīng)頻率比較低，因此就需要高靈敏的方法來(lái)檢測(cè)Th2反應(yīng)。ELISpot還可在特異性免疫治療中監(jiān)測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)，開(kāi)發(fā)體外診斷測(cè)試方法等。ELISpot常用于檢測(cè)IL-4，IL-4是Th2型反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，用流式和ELISA檢測(cè)時(shí)常常由于靈敏性低導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。ㄒ?jiàn)圖3）。

圖3.外周血單核細(xì)胞對(duì)鎳體外過(guò)敏反應(yīng)。斑點(diǎn)測(cè)試反應(yīng)顯示+++ (n=10), ++ (n=11), + (n=10) , 0 (controls; n=10)。單核細(xì)胞中加入50 μM NiCl2孵育40小時(shí)，31個(gè)過(guò)敏個(gè)體用ELISpot可檢測(cè)到23個(gè)，而ELISA只檢測(cè)到4個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)。

其它類(lèi)型細(xì)胞分析
最初，ELISpot用于計(jì)算細(xì)胞分泌的特異性抗體。近幾年，B細(xì)胞ELISpot的發(fā)展，使ELISpot技術(shù)得以復(fù)蘇，主要用于檢測(cè)B細(xì)胞感染反應(yīng)和疫苗引起的感染。
從理論上講，ELISpot可以應(yīng)用于任何單細(xì)胞水平的檢測(cè)。例如脂多糖刺激外周血單核細(xì)胞分泌的IL-1β和 IL-6定量研究（見(jiàn)圖4.）。還可用于少數(shù)細(xì)胞的研究，例如漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞，它在血液中的出現(xiàn)頻率很低，但用ELISpot可以很容易檢測(cè)到它的產(chǎn)物IFN-α。

圖4. ELISpot分析脂多糖刺激人外周血單核細(xì)胞后分泌的IL-1β 和 IL-6。加入脂多糖(100ng/ml)后孵育細(xì)胞(5,000 cells/well)20小時(shí)，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

技術(shù)

試驗(yàn)方法優(yōu)化
ELISpot方法有幾個(gè)關(guān)鍵步驟，高特異性抗體選擇是最重要的一步，其它關(guān)鍵參數(shù)包括ELISpot板的選擇、包被程序等。包被前PVDF板用乙醇處理，可以增加聯(lián)接捕獲抗體的能力。事實(shí)上，不同的板子對(duì)乙醇的反應(yīng)也不一樣，因此選擇合適的方法很關(guān)鍵。如果乙醇處理恰當(dāng)，斑點(diǎn)的質(zhì)量和數(shù)量比未經(jīng)乙醇處理的要好很多。值得注意的是，過(guò)度乙醇處理（乙醇體積過(guò)大或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)）會(huì)降低實(shí)驗(yàn)效率（見(jiàn)圖5）。
捕獲抗體一般推薦15μg/ml（100μl/well），如果捕獲抗體濃度小于15μg/ml，斑點(diǎn)會(huì)呈彌散狀，影響后續(xù)計(jì)算。在許多細(xì)胞因子ELISpot實(shí)驗(yàn)中，捕獲抗體數(shù)量越少，斑點(diǎn)的損失就越大。因此，設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)要考慮到捕獲抗體的數(shù)量，尤其是生成細(xì)胞頻率較低或細(xì)胞因子數(shù)量較少時(shí)。
最后一步加入沉淀底物，不同的酶(ALP或HRP)使用不同的底物，不同的底物產(chǎn)生不同的顏色，而且靈敏度也不一樣（見(jiàn)圖6）。一般情況下，我們推薦ALP 使用BCIP/NBT；HRP 使用TMB。這兩種酶的靈敏性非常好，都可以產(chǎn)生清晰的斑點(diǎn)。

圖 5. 包被前乙醇處理MSIP對(duì)結(jié)果的影響，Mabtech預(yù)包被板的比較。用CEF肽刺激人的外周單核細(xì)胞(250,000 cells/well)，然后檢測(cè)IFN-γ產(chǎn)量。

圖6. ELISpot通用底物。不同的酶(ALP 或 HRP)交聯(lián)不同的底物。以IFN-γ ELISpot為例，ALP使用BCIP/NBT，HRP 使用TMB 和AEC。
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