該免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法僅供參考，由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的試劑不同，并且涉及不同的物種，組織類型及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟和改良。
-切片制備
A. 細(xì)胞涂片
將培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)于無菌的蓋玻片或載破片上，37℃過夜孵育。
用PBS簡(jiǎn)單洗滌。
按需固定. 可用的步驟有:
含10% 福爾馬林的PBS 固定10分鐘 (保持濕潤(rùn)).
冰冷的甲醇固定5分鐘，自然干燥。
冰冷的丙酮固定5分鐘，自然干燥。
用PBS沖洗。
B. 冷凍組織切片
在液氮或用液氮預(yù)冷的異戊烷中切割冷凍的新鮮組織， 放置于含有OCT凍存液的cryomolds被膜中. 速凍后保存在 – 80 ?C。
用恒冷箱切片機(jī)將組織切成4-8 um 厚的切片，然后固定在急凍切片或明膠包被過的切片。使用前將切片保存于 – 80℃。
染色之前，將切片置于室溫下 30分鐘然后于冰冷的丙酮中固定5分鐘。自然干燥30分鐘。
在PBS中漂洗。
C. 石蠟組織切片
將切片在二甲苯中去石蠟兩次，每次5min.
使用100% 乙醇水化兩次，每次3min.
使用95%乙醇水化 1min.
蒸餾水漂洗.
按需根據(jù)預(yù)制備步驟操作.
-組織切片預(yù)制備
*對(duì)于非石蠟包埋的冷凍切片和培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)不要使用該預(yù)制備步驟。
被福爾馬林固定和石蠟包埋封閉的抗原決定簇可以使用抗原修復(fù)劑、酶消化或肥皂精等來使之顯示。
-步驟
在PBS-Tween 20 中漂洗切片兩次，每次2分鐘。
血清封閉: 用正常血清封閉孵育切片 – 物種來源應(yīng)與二抗相同, 孵育30分鐘來封閉非特異的免疫球蛋白結(jié)合。 注意：由于該實(shí)驗(yàn)使用的 avidin-biotin 檢測(cè)系統(tǒng), 根據(jù)組織類型不同，可能需要avidin/biotin 封閉，avidin/biotin 封閉應(yīng)在正常血清封閉之后。
一抗: 在一抗溶液中孵育切片，室溫下1小時(shí)或4℃過夜。
在PBS-Tween 20中漂洗。
二抗： 在生物素化二抗溶液中孵育切片，室溫下30分鐘。
用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分鐘。
檢測(cè): 在含F(xiàn)ITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片，室溫下30分鐘。從該步驟開始要確保切片避光，直到最后將切片用鋁箔紙包裹或放進(jìn)避光盒子中。
用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分鐘。
如需要，用PI 或 DAPI 復(fù)染色。
在PBS-Tween 20中漂洗。
用95% 乙醇脫水 2 分鐘, 100% 乙醇脫水兩次，每次3分鐘。
用抗褪色固定介質(zhì)覆蓋切片。
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