外泌體(Exosome)是發(fā)現(xiàn)于1986年，一種直徑約30~150nm的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)小體，可由機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞如免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、心血管細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板、神經(jīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等主動(dòng)分泌產(chǎn)生，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等體液中。

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)。由于外泌體的特殊結(jié)構(gòu)和功能，使得它具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標(biāo)，另一方面也可以作為治療手段，未來(lái)有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療。

外泌體的研究日益活躍并令人矚目。但是，由于外泌體的納米尺寸，同其它類型的胞外囊泡在理化和生化特征上部分重疊，以及自身在大小、組成和功能方面存在異質(zhì)性，其分離純化也面臨挑戰(zhàn)。下面小欣給大家從文獻(xiàn)中總結(jié)出了目前幾大主流外泌體純化方法，供大家參考。

1、差速離心法（UC）

通過(guò)差速超速離心分離外來(lái)體通常包括一系列不同離心力和持續(xù)時(shí)間的離心循環(huán)，以根據(jù)外來(lái)體與樣品中其他成分的密度和大小差異來(lái)分離外來(lái)體，是目前最常用的分析方法。

優(yōu)勢(shì)：降低了使用分離試劑造成的污染和成本；樣本處理量大，產(chǎn)量高。

缺點(diǎn)：儀器成本投入高，笨重，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，耗人力，不便攜；超速離心可能破壞外泌體而影響下游分析；經(jīng)常存在雜蛋白和脂蛋白污染。

2、基于大小的分離技術(shù)

超濾離心法也是目前很常用的純化方法之一，其采用不同膜大小和截留分子量（MWCO）的膜過(guò)濾器，使大于MWCO的顆粒留下，而小于MWCO的顆粒被丟棄，超濾法作為一種有效的濃縮方法經(jīng)常與其他外泌體分離方法聯(lián)合應(yīng)用。

分子排阻層析(SEC)也常被報(bào)道用于外泌體制備，使用具有化學(xué)惰性和穩(wěn)定性的多孔填料，采用非吸附的層析方法，按照不同大小分子流經(jīng)的路徑長(zhǎng)短不同來(lái)進(jìn)行樣品分離。外泌體在填料的排阻極限之外，無(wú)法進(jìn)入填料的孔隙中，而緊跟著外水體積最先排出；蛋白等其它雜質(zhì)由于分子量小，可以進(jìn)入填料孔隙中，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的路徑而晚出峰，由此分離。

優(yōu)勢(shì)：超濾：快速，不需要特殊儀器，便攜。將RNA提取液流經(jīng)膜可直接用于RNA抽提。SEC：較高純度外泌體；通常在重力流下操作從而保留了外泌體的完整性和生物活性；可重復(fù)性好；中度樣本處理量。

缺點(diǎn)：超濾：儀器成本低，中等純度；剪切力可引起外泌體損傷；有可能造成聚集和囊泡陷入膜孔中，或外泌體吸附在膜上而損失。SEC：儀器成本中等，需要專用的設(shè)備；不易放大，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)。

3、外泌體沉淀（PEG-base）

聚乙二醇(PEG)，它在水中具有超溶性，可以“束縛”水分子，迫使較難溶的成分，如EV、外泌體、蛋白質(zhì)和其它較難溶的成分從溶液中分離出來(lái)。通常是4℃用PEG孵育樣品過(guò)夜，隨后通過(guò)低速離心或過(guò)濾即可沉淀回收外泌體。

優(yōu)勢(shì)：容易操作，不需要特殊儀器；樣本處理量大，具有可放大性。

缺點(diǎn)：缺乏選擇性的分離機(jī)制，容易和非外泌體污染共沉淀，如其它胞外囊泡、蛋白聚集體、 高豐度蛋白等；運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，需要在分離前先去除脂蛋白等亞細(xì)胞顆粒，在分離后去除聚合物材料。

4、免疫親和捕獲技術(shù)

免疫捕獲過(guò)程需要使用微珠，通常約1μm，其帶有鐵核，通常被稱為磁珠，這些磁珠表面包被有可識(shí)別外泌體表面標(biāo)記物(如CD9、CD63和CD81)的捕獲分子。捕獲分子通常是抗體，但也可能是配體或納米小體。磁珠可生產(chǎn)用于捕獲一個(gè)表面標(biāo)記，如CD63，或使用泛捕獲方法捕獲所有這三個(gè)表面標(biāo)記。

優(yōu)勢(shì)：針對(duì)特定來(lái)源或亞群的外泌體分離是很好的選擇；相比于其它分離方法，純度要高出很多；利于外泌體的分型。

缺點(diǎn)：試劑成本高，需要預(yù)先確認(rèn)好的外泌體標(biāo)簽(抗原)；樣本處理量低，只有帶標(biāo)簽的外泌體被識(shí)別而產(chǎn)量低；僅適用于Cell-free樣品；腫瘤的異質(zhì)性妨礙了免疫識(shí)別，可能會(huì)造成假陰性；抗原表位可能被封閉或掩藏。

5、微流控技術(shù)

微尺度下，利用外泌體的生理和生化特性進(jìn)行分離，如免疫親和特性、大小和密度，結(jié)合新興的聲波納濾、電磁和電泳等技術(shù)。微流控技術(shù)包括捕獲微流控技術(shù)、過(guò)濾微流控技術(shù)、磁分離微流控技術(shù)、聲學(xué)分離微流控技術(shù)和介電泳微流控技術(shù)等。

優(yōu)勢(shì)：快速、低成本、高度便攜、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可將外泌體分離和后續(xù)檢測(cè)進(jìn)行集成。

缺點(diǎn)：缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和大規(guī)模的臨床樣本測(cè)試，缺少方法驗(yàn)證，低/中等程度的樣本處理量。

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