免疫熒光（IF）實驗步驟的一般流程：
1.用聚乙烯亞胺或多聚賴氨酸涂覆蓋玻片，在室溫下放置 1 小時。
2. 用無菌水充分漂洗蓋玻片3 次，每次1 小時。
3. 充分干燥蓋玻片，在紫外光下滅菌至少4 小時。
4. 使細胞在玻璃蓋玻片上生長。
5. 用磷酸鹽緩沖液(PBS) 簡單漂洗。 推薦使用1 × PBS 0.1% Tween 20 作為洗滌緩沖液。
固定?
可使用以下兩種方法中的一種固定細胞：?
1.室溫下，在100% 甲醇（-20 ℃ 冷凍）中孵育細胞5 分鐘。
2. 室溫下，在4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中，pH 7.4）中孵育細胞 10 分鐘。 用冰PBS 洗滌細胞3 次。?
抗原修復（可選步驟）?
在抗原修復緩沖液對細胞進行加熱處理后，有些抗體的效果會更好。查看產(chǎn)品信息，了解每種一抗的使用建議。
1. 將抗原修復緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）預熱至 95 ℃。具體方法為：將裝有緩沖液的蓋玻片染色缸置于水浴鍋中，水浴鍋的溫度設 為 95 ℃。
2. 用小型寬頭鑷子小心將蓋玻片置于蓋玻片染色缸內(nèi)的抗原修復緩沖液中，記下長 有細胞的蓋玻片面。?
3. 在 95 ℃ 下加熱蓋玻片10 分鐘。?
4. 從抗原修復緩沖液中取出蓋玻片，浸入 6 孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的PBS 溶液中，保持 長有細胞的一面朝上。?
5. 用 PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。?
通透?
1.如果靶蛋白位于細胞內(nèi)，對細胞進行通透處理尤為關(guān)鍵。用甲醇固定的樣品不需要進行 通透處理。 用PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin）孵育樣品10 分鐘。Triton X-100 是用于提高抗體滲透性最常用的 去垢劑。但 Triton X-100 會破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜抗原。
2.確定每種目標蛋白的Triton X-100 最佳比例。
3.用 PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。?
封閉與免疫染色?
1.用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細 胞30 分鐘，封閉抗體的非特異性結(jié)合（可替代的封閉液包括 1% 明膠或來源于產(chǎn)生 二抗的物種的10% 血清：查看抗體數(shù)據(jù)表了解相關(guān)建議）。
2.室溫下，用稀釋抗體（溶于 1% BSA 的PBST 中）在濕盒中孵育細胞1 小時， 或4 ℃ 過夜孵育。倒出溶液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
3.室溫下，用二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞1 小時。
4.倒出二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
多色染色（可選步驟）
要檢測同一個樣品中兩種或多種抗原的共同分布情況，需要使用雙重免疫熒光流程。該流程可在混合物中同時進行檢測，也可逐個抗原依次進行檢測。?
確?？贵w來源于不同物種并且這些抗體有相應的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗體和抗抗 原B 的鼠抗體。也可使用偶聯(lián)至不同熒光團的直標一抗。
同時孵育
1. 用封閉液孵育細胞30 分鐘。
2. 室溫下，用兩種一抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）在濕盒中孵育細胞1 小 時，或4 ℃ 過夜孵育。
3. 倒出溶液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
4. 室溫下，用兩種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞1 小時。
5. 倒出二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
依次孵育?
1. 第一封閉步驟：室溫下，用第一封閉液（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血 清）孵育細胞 30 分鐘。
2. 室溫下，用第一種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在濕盒中孵 育細胞1 小時，或4 ℃ 過夜孵育（一抗溶于 1% 明膠或 1% BSA 的PBST 中）。
3. 倒出第一種一抗溶液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
4. 室溫下，用第一種二抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）避光孵育細胞1 小時。
5. 倒出第一種二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
6. 第二封閉步驟：室溫下，用第二種血清（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血 清）避光孵育細胞30 分鐘。
7. 室溫下，用第二種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在濕盒中避 光孵育細胞1 小時，或4 ℃ 過夜孵育。
8. 倒出第二種一抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。
9. 室溫下，用第二種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞1 小時。
倒出第二種二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。?
如需檢測兩種以上的抗原，其余抗體按照步驟1–5 繼續(xù)操作
復染?
1.用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI（DNA 染色）孵育細胞 1 分鐘。
2. 用 PBS 漂洗細胞。
封片?
1. 用一滴封片介質(zhì)封閉蓋玻片。?
2. 用指甲油密封蓋玻片，避免樣品變干和在顯微鏡下移動。?
3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。
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