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內(nèi)毒素污染及檢測方法(試劑)

2022-04-13
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內(nèi)毒素,又稱脂多糖(LPS),是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要細(xì)胞壁成份。內(nèi)毒素的來源包括培養(yǎng)基、血清、水、緩沖溶液和其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑,如胰蛋白酶。內(nèi)毒素是體內(nèi)外炎癥反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑。內(nèi)毒素污染是細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)注射藥物中的主要問題。溶液和試劑可能是無菌但仍含有細(xì)菌成分,因此監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)試劑中是否存在內(nèi)毒素至關(guān)重要。


內(nèi)毒素污染及檢測方法(試劑)

內(nèi)毒素的特點:

? 3 - 40 kDa:取決于O抗原的大小

? 兩親性:>1000 kDa 會在水溶液中形成聚集物

? 抗紫外線和熱穩(wěn)定性 (最高180°C)

? 多糖:大小因細(xì)菌種類而異。在人體誘導(dǎo)特異性抗原反應(yīng)。

? 脂質(zhì)A:具有LPS毒性。刺激哺乳動物免疫系統(tǒng)。


內(nèi)毒素的污染源:

1.水

使用高純度水制備培養(yǎng)基和溶液,清潔玻璃器皿。

2.玻璃器皿

為了消除內(nèi)毒素,必須將玻璃器皿加熱至250°C(≥30分鐘),或加熱到180°C(3 小時)。

3.培養(yǎng)液、血清和添加劑

使用前要求制造商提供內(nèi)毒素水平認(rèn)證或測試。

4.塑料容器

要求制造商提供內(nèi)毒素水平和無致熱源的證明。


體外和體內(nèi)實驗的風(fēng)險

內(nèi)毒素污染及檢測方法(試劑)

內(nèi)毒素在體外和體內(nèi)實驗均可引起不穩(wěn)定性。脂質(zhì)A能夠激活細(xì)胞表面或內(nèi)體的Toll樣受體4(TLR4),誘導(dǎo)MAP激酶(MAPK)及IRF(干擾素調(diào)節(jié)因子)通路的激活20, 21。盡管內(nèi)毒素的作用隨濃度和細(xì)胞類型的不同而改變,但它們確實可以改變細(xì)胞形態(tài)、影響增殖和轉(zhuǎn)染效率22。此外,LPS還誘導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子如TNF-α 、IL-1β 、IL-6 、IL-8 和 IL-18的產(chǎn)生,并激活 caspase 4/5/11-NLRP3 非經(jīng)典炎癥小體,最后導(dǎo)致細(xì)胞焦亡20, 23。在體內(nèi)實驗,低內(nèi)毒素濃度可刺激免疫系統(tǒng),而高濃度可引起發(fā)燒、低血壓、多器官衰竭,甚至死亡22。


使用生物試劑檢測內(nèi)毒素


細(xì)胞比色分析法


HEK-Blue? LPS Detection Kit 2

??用途廣泛:適用于幾乎所有的生物試劑

??高靈敏度:檢測限為 0.01 EU/ml

? 經(jīng)濟(jì)實惠:1個試劑盒最多可進(jìn)行500次測試


試劑盒依賴于InvivoGen專有的HEK-Blue?-4細(xì)胞,該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)人源TLR4和一個NF-κB誘導(dǎo)的分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)報告基因。簡單的實驗程序使該試劑盒成為常規(guī)測試的理想選擇。只要樣品中含有微量的LPS,在與HEK-Blue?-4細(xì)胞孵育過夜后,會導(dǎo)致NF-κB的激活和SEAP報告基因的表達(dá)。培養(yǎng)上清液中的SEAP活性通過加上底物QUANTI-Blue?溶液,并使用分光光度計在620-655nm的波長測量。吸光度與內(nèi)毒素含量成正比。使用試劑盒中提供的HEK-Blue?內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)系列稀釋獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計算內(nèi)毒素濃度(大腸桿菌055:B5 LPS 的制備參照FDA批準(zhǔn)的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)制備標(biāo)準(zhǔn))。HEK-Blue? LPS檢測試劑盒2也是InvivoGen內(nèi)部的常規(guī)內(nèi)毒素檢測方法。


LPS檢測試劑盒2的原理(見下圖)

內(nèi)毒素污染及檢測方法(試劑)


使用此試劑盒的5大原因


1.替代昂貴而耗時的鱟試劑(LAL)。購買此套件一次,凍存HEK-Blue?-4細(xì)胞,以后只需重新訂購其他耗材。

2.與LAL分析不同,如果樣品含有(1,3)-β-D-葡聚糖,使用HEK-Blue?-4細(xì)胞進(jìn)行LPS檢測不會導(dǎo)致假陽性。

3.適用于所有生物樣品,包括培養(yǎng)基、血清、化學(xué)制劑和疫苗佐劑。

4.溶液顏色從粉紅色變?yōu)樽?藍(lán)色表示陽性反應(yīng),結(jié)果簡單可視。

5.包括一本實驗程序小冊子,計算內(nèi)毒素濃度的方法,以及疑難排解部分


相關(guān)文獻(xiàn):

— Gray M. A. et al., 2020. Nat Chem Biol. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. DOI: 10.1038/s41589-020-0622-x.

— Imbert P. R. C. et al., 2021. Curr Biol. An Acquired and Endogenous?

Glycocalyx Forms a Bidirectional “Don’t Eat” and “Don’t Eat Me” Barrier to Phagocytosis. DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.082.


訂購產(chǎn)品:

產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品說明規(guī)格貨號
HEK-Blue? LPS Detection Kit 2Assay for the detection and quantification of biologically active LPS1 kitrep-lps2
HEK-Blue? SelectionAntibiotics for maintenance of HEK-Blue? cells10 x 1 mlhb-sel
HEK-Blue? Endotoxin StandardStandardized E. coli 055:B5 LPS10 x 50 EUrep-hbes-10
QUANTI-Blue? SolutionAlkaline phophatase detection medium (liquid form, 100X)?5 ml

10 ml

rep-qbs

rep-qbs2


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