TransIT-X2^??DYNAMIC DELIVERY SYSTEM

高效??— —?完美的廣譜轉(zhuǎn)染試劑

實用性廣?— —?可以適合用于DNA質(zhì)粒，siRNA/miRNA以及RNP復(fù)合物

科技?— —?非脂質(zhì)體，陽離子聚合物遞送

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Mirus X2轉(zhuǎn)染系統(tǒng)通過創(chuàng)新的聚合物體系有效地將DNA和RNA從核內(nèi)體遞送到細(xì)胞質(zhì)中，克服了核酸遞送的關(guān)鍵障礙。

圖1.TransIT-X2^??Dynamic Delivery System可在多種細(xì)胞類型中實現(xiàn)較高水平的基因表達(dá)

TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine^?2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific）試劑與DNA?3:1將編碼熒光素酶的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到41種不同的細(xì)胞類型中。使用標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶測定法比較轉(zhuǎn)染后24小時的熒光素素酶的表達(dá)。在優(yōu)化比例下實驗結(jié)果比較表明，使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在41種細(xì)胞類型中的36種細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)優(yōu)于或者等于競爭品牌；在17種細(xì)胞中TransIT-X2^??Dynamic Delivery System是Lipofectamine^?2000表達(dá)水平的2倍，具體細(xì)胞在圖中用?表示。

圖2. 使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System細(xì)胞中GFP表達(dá)水平較高

TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）將編碼EGFP的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到A549、CHO-K1、HepG2、LNCaP、MDCK、PC-12、原代人乳腺上皮細(xì)胞（HMEC）和原代正常人真皮成纖維細(xì)胞（NHDF）。使用4-8μl TransIT-X2^?（MirusBio）遞送2μg DNA。使用Zeiss Axiovert S100在轉(zhuǎn)染后48小時拍照（32X）倒置熒光顯微鏡?*代表原代細(xì)胞。

圖3.使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System在多個細(xì)胞系和原代細(xì)胞中的GFP轉(zhuǎn)染效率較高

使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）將編碼EGFP的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮細(xì)胞（HMEC）和原代正常人真皮成纖維細(xì)胞（NHDF）中。使用0.2-0.4μl?TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在96孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以遞送0.1μg DNA（轉(zhuǎn)染試劑：DNA的比率2:1、3:1或4:1）。轉(zhuǎn)染48小時后，用guava^??easyCyte? 5HT流式細(xì)胞儀（MilliporeSigma）對三個孔進(jìn)行分析。?*代表原代細(xì)胞。

圖4. 使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA和siRNA

使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）將Cy^?5標(biāo)記的編碼核YFP質(zhì)粒DNA和Cy^?3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞。使用4μL TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在6孔板中用聚-L-賴氨酸（PLL）涂層的蓋玻片進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以遞送2μg DNA（2:1試劑：DNA比）和25 nM siRNA。使用Alexa Fluor^?350 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）對肌動蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。在轉(zhuǎn)染后24小時使用Nikon A1R共焦顯微鏡拍攝圖像（63X）。圖像：黃色（核YFP）、藍(lán)色（Cy^?5標(biāo)記的DNA）、紅色（Cy?3標(biāo)記的siRNA）、綠色（肌動蛋白細(xì)胞骨架）。

圖5. TransIT-X2^??Dynamic Delivery System比Lipofectamine^?2000具有更高的敲除率

TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine^?2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific）用于轉(zhuǎn)染靶向內(nèi)源性蛋白GAPDH和aha1的siRNA，或在原代正常人真皮成纖維細(xì)胞（NHDF）中遞送非靶向?qū)φ铡８鶕?jù)說明書，使用4μl TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）或6μl Lipofectamine^?2000（Thermo Fisher Scientific）和25nM siRNA在6孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用qRT-PCR測定GAPDH或aha1mRNA相對于18S rRNA水平的量，然后在轉(zhuǎn)染后48小時縮放到陰性對照的mRNA水平。誤差條表示孔中的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖6.使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System有效遞送miRNA?可降低PTK9 mRNA水平

TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine^?2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific）用于轉(zhuǎn)染帶有Pre-miR??hsa-miR-1 miRNA前體（Thermo Fisher Scientific）或mirVana? miRNA模擬物（Thermo Fisher Scientific）的T47D細(xì)胞?。miR-1兩者都能降低PTK9 mRNA水平。轉(zhuǎn)染Pre-miR陰性對照以評估基線mRNA水平。根據(jù)每個制造商的方案，使用3μl TransIT-X2^?（Mirus Bio）或Lipofectamine^?2000（Thermo Fisher Scientific）和50 nM miRNA在12孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用qRT-PCR測量PTK9 mRNA相對于18S rRNA水平的量，然后在轉(zhuǎn)染后48小時將其換算為陰性對照的mRNA水平。誤差條表示復(fù)孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。?

TransIT-X2^??Dynamic Delivery System用于CRISPR基因編輯

質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染

Cas9蛋白和gRNA都可以由質(zhì)粒DNA編碼用于轉(zhuǎn)染。或者Cas9可以像質(zhì)粒DNA一樣被轉(zhuǎn)染，gRNA可以作為RNA寡核苷酸。

這些方法的優(yōu)點包括：

●?低成本-質(zhì)粒DNA是一種可再生、經(jīng)濟(jì)高效的格式

●?靈活性-Cas9和gRNA質(zhì)粒適用于穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染

●?易于使用-gRNA寡核苷酸格式可將Cas9簡單地重新定位到不同的位點

圖7.用Cas9質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸進(jìn)行高效基因組編輯

使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（24孔板的2μl/孔，Mirus Bio），用0.5μg編碼pDNA的Cas9（Millipore Sigma）和50 nM PPIB靶向兩部分gRNA（Dharmacon/GE Healthcare）共轉(zhuǎn)染HEK 293T/17、U2OS和NHDF細(xì)胞。T7E1錯配檢測法用于測定轉(zhuǎn)染后48小時的切割效率。

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Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）轉(zhuǎn)染

純化的Cas9蛋白可與gRNA結(jié)合，形成RNP復(fù)合物，將其遞送至細(xì)胞，用于快速高效的基因組編輯。

基于RNP的基因組編輯的好處

●?高效轉(zhuǎn)染-將Cas9/gRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染至多種細(xì)胞類型，包括難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞和干細(xì)胞

●?高特異性-預(yù)先形成的RNP復(fù)合物提供基因組編輯活動的快速脈沖

●?無DNA-無插入突變風(fēng)險

圖8. TransIT-X2^?在RNP轉(zhuǎn)染方面優(yōu)于其他試劑

使用TransIT-X2^??Dynamic Delivery System（1μl/孔，Mirus Bio）或Lipofectamine^?CRISPRMAX? （1.5μl/孔和1μl/孔Lipofectamine^?Cas9 Plus? 試劑，Thermo Fisher）或Lipofectamine^?RNAiMAX（1.5μl/孔，Thermo?Fisher）或Lipofectamine?3000（1.5μl/孔和1μl/孔P3000? 試劑，Thermo Fisher）將由靶向2部分gRNA（IDT）的PPIB（親環(huán)蛋白B）和Cas9蛋白（PNA Bio）組成的蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物遞送到（A）HEK 293T/17和（B）U2OS細(xì)胞中。根據(jù)操作手冊，采用24孔板，用6nM Cas9蛋白（PNA Bio）測試不同水平的gRNA（6nM或12nM）。T7E1錯配檢測法用于測定轉(zhuǎn)染后48小時的切割效率。

圖9.用Cas9和gRNA核糖核蛋白復(fù)合物在IPS細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯

TransIT-X2^??Dynamic Delivery System用于在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）中轉(zhuǎn)染Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物。T7E1錯配方法用于測定轉(zhuǎn)染后48小時的切割效率。

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