什么是免疫組織化學
免疫組織化學(Immunohistochemistry)或免疫細胞化學(immunocytochemistry), 是應用免疫學基本原理---抗原抗體反應, 即抗原與抗體特異性結合的原理, 通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質), 對其進行定位、定性及定量的研究技術。
免疫組化將免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來, 借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用, 在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體及受體等)。
免疫組化標本
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類, 前者包括石蠟切片和冰凍切片, 后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。
其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法, 對于組織形態(tài)保存好, 且能作連續(xù)切片, 有利于各種染色對照觀察; 還能長期存檔, 供回顧性研究。石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響, 但可進行抗原修復, 是免疫組化中首選的組織標本制作方法。
免疫組化檢測方法
>>直接法
直接法又稱一步法, 采用帶標記的抗體(如FITC)直接作用于組織切片上的抗原。該技術僅需一種抗體, 流程簡短、快速。但因為沒有信號放大系統(tǒng), 直接法靈敏度不高。隨著間接法的引入, 直接法應用逐漸減少。
>>PAP法
PAP(peroxidase anti-peroxidase), 即過氧化物酶-抗過氧化物酶法。該法是間接法的進一步改進, 涉及第三層過氧化物酶標記的過氧化物酶抗體。該抗體與第二層未標記抗體結合。因為過氧化物酶分子不是通過化學方法與IgG結合而是通過免疫結合, 故靈敏度高出100-1000倍。PAP法一抗的稀釋倍數(shù)增高, 可減少非特異性的背景染色。
>>ABC法
ABC(avidin-biotin-complex)代表的是親和素-生物素-過氧化物酶復合物。利用親和素分別連接生物素標記的第二抗和生物素標記的酶。但是此法注意內源性生物素活性的消除, 以減少非特異性的染色。
>>間接法
間接法涉及一個未標記的一抗(第一層，直接跟組織抗原反應)和一個標記的二抗(第二層, 與一抗反應)。因為二抗可跟一抗上多個不同的抗原位點結合, 放大信號, 從而提高了該法的靈敏度。當二抗標記上熒光染料, 如FITC、羅丹明、德克薩斯紅等, 即是間接免疫熒光法。當二抗標記上酶, 如過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶, 即是間接免疫酶法。
>>SP法
SP(streptavidin-perosidase)法, 即鏈親和素-過氧化物酶連結法, 是采用生物素標記的第二抗體與鏈親和素連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細胞或組織中的抗原。鏈親和素是一種金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質, 它能與各種動物的IgG的Fc段結合, 在免疫組化中可作為橋連抗體或標記抗體。最大的優(yōu)點是不受種屬的特異性限制。此法還具有染色時間短、靈敏度高、背景染色淡等優(yōu)點, 分子量小, 易于穿透組織。
※ ABC法? VS SP法
ABC法的'三抗'是SABC復合物即鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物
SP法的'三抗'是過氧化物酶直接與鏈酶親和素相連的, 沒有通過生物素的中介連接
免疫組化常用染色方法
根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法、免疫酶標法和免疫膠體金技術。
| >>免疫熒光法 | >>免疫酶標法 | >>免疫膠體金法 |
免疫熒光染色是最早出現(xiàn)的免疫組化的染色方法?；诳乖贵w的免疫反應, 結合抗原的帶熒光標記的抗體在熒光顯微鏡下通過特殊波段的激發(fā)從而發(fā)出熒光, 以此定位結合抗原的位置。免疫熒光因其高靈敏性、特異性、簡便性, 被廣泛應用于醫(yī)學分析和診斷。 | 
在免疫酶染色法中, 酶標記的抗體與組織或細胞內的特異性抗原相結合。加入酶顯色底物后, 形成不可溶性物質, 通過顯微鏡 可觀察定位。
| 免疫膠體金法采用膠體金作為標記物, 這種特殊的金屬離子呈膠體形式, 可快速穩(wěn)定地結合蛋白質。此外, 膠體金幾乎不影響天然蛋白質的生物活性。因此膠體金是一種理想的材料, 用于結合一抗、二抗或其他蛋白的IgG部位, 從而定位組織或培養(yǎng)細胞上的特定抗原。由于膠體金離子的大小和電子密度不同, 免疫膠體金法可適用于免疫電子顯微鏡或光學顯微鏡下單或多標記檢測。 |
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