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Funakoshi精品推薦——LipiDye Ⅱ 脂滴活細胞成像試劑

2024-05-13
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Funakoshi LipiDye II是一款適用于長時間活細胞成像以觀察動態(tài)脂滴(LDS)合成、移動或降解的綠色熒光染料;是LipiDye(貨號:FDV-0010)的升級版,同時具備超強的光穩(wěn)定性和高靈敏度等特點。

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??產(chǎn)品信息

貨號

FVD-0027

規(guī)格

0.1mg

化學式

C26H17NO2S2

分子大小

439.5 g/mol

溶解性

溶于DMSO

熒光特性

Ex. 400-500 nm(maximum ~420 nm)

與藍色激發(fā)激光器(如405、445、458、473和488 nm*激光器等)、氙燈或帶有商用FITC或GFP濾光片的LED兼容;

注:488 nm可激發(fā)LipiDye II,但與473 nm激發(fā)相比熒光較弱。

如果使用488 nm激光,請根據(jù)實驗經(jīng)驗優(yōu)化成像條件,如染料濃度等。

Em. 450-650 nm(取決于溶劑)

如豆油的最大值~510nm,與LD相似。建議在490-550 nm范圍內(nèi)使用。

??產(chǎn)品特點

? 可檢測非脂肪細胞中直徑?

???適用于長時間活細胞成像,具有超強的光穩(wěn)定性。

???適用脂滴分解與合成。

???適用于脂肪細胞分化過程,時間可長達8天。

???適用于活細胞、固定處理的細胞以及活細胞染色后再固定細胞染色。

???推薦使用濃度為0.1~1 μM,對細胞幾乎無毒性。

???可對細胞脂滴進行半定量分析。

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●?脂滴與LipiDye II

脂滴(Lipid droplets,LDs)是一種具有獨特的單層磷脂,可儲存甘油三酯和甾醇酯等中性脂質(zhì)的細胞器(圖1)。LDs普遍存在于脂肪細胞中,具有儲存能量和脂質(zhì)運輸?shù)墓δ?。研究發(fā)現(xiàn),LDs不僅存在于脂肪細胞,還存在肝細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等其他非脂肪細胞中,明確LDs具有調(diào)節(jié)代謝以及保護鄰近細胞免受脂質(zhì)毒性的功能。LDs的數(shù)量大小以及組成因細胞類型的不同而不同。例如,脂肪細胞中LDs的直徑?>?10μm,可通過光學顯微鏡觀察到;而非脂肪細胞中LDs的直徑在0.1μm~1μm(圖2)。因此,實現(xiàn)可以檢測出活細胞中非脂肪細胞的微小LDs的動態(tài)運動及功能將是一個重要突破。

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傳統(tǒng)的LDs熒光染料(如尼羅河紅)僅限于檢測脂肪細胞或經(jīng)過量脂質(zhì)處理的細胞中相對較大的LDs;在活細胞條件下無法實現(xiàn)檢測存在于非脂肪細胞的微小LDs。Funakoshi的LipiDye(貨號:FDV-0010)可檢測1μm大小的LDs,雖然其具備高靈敏度和高選擇性,但LipiDye需要405?nm的激發(fā)波長,光穩(wěn)定性不足,不適合用于長期活細胞成像以觀察動態(tài)LDs的合成、移動或降解。

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因此,F(xiàn)unakoshi又推出了LipiDye的升級版—LipiDye II,可被毒性較低的450-480 nm激發(fā),并具有超強的光穩(wěn)定性;同時適用于長時間活細胞成像,包括短期多時間激發(fā)的Z-stack延時成像。

Funakoshi精品推薦——LipiDye Ⅱ 脂滴活細胞成像試劑

圖1 脂滴的結(jié)構(gòu)與組成


Funakoshi精品推薦——LipiDye Ⅱ 脂滴活細胞成像試劑

圖2?脂滴在脂肪細胞和非脂肪細胞的直徑大小

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●?活細胞成像的一般步驟

1、在無血清、無酚紅的培養(yǎng)基中配制1 μM的LipiDye II;

(注:LipiDye II可與含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基兼容,但需優(yōu)化FBS和LipiDye II的濃度;推薦濃度0.1 μM用~405 nm激發(fā),濃度1μM用~473 nm激發(fā);根據(jù)實驗經(jīng)驗優(yōu)化并確定LipiDye II的濃度)

2、去除培養(yǎng)基,用PBS沖洗細胞數(shù)次;

3、向細胞中加入含LipiDye II的培養(yǎng)基;

4、37℃孵育30分鐘以上(注:根據(jù)實驗經(jīng)驗優(yōu)化孵育時間);

5、使用PBS或培養(yǎng)基清洗細胞并加入新鮮培養(yǎng)基(可選);

6、觀察細胞。

Funakoshi精品推薦——LipiDye Ⅱ 脂滴活細胞成像試劑


??參考數(shù)據(jù)

●?LipiDye II的光譜

Funakoshi精品推薦——LipiDye Ⅱ 脂滴活細胞成像試劑?

圖A:LipiDye II的吸收光譜幾乎不受溶劑影響,可觀察LipiDye II在400?nm~500?nm的吸收。

圖B:LipiDye II在不同溶劑中有不同的發(fā)射光譜。如在甲苯和二氯甲烷等低極性溶劑中,它發(fā)出的熒光從藍色到綠色,量子產(chǎn)率高;另一方面,在高極性溶劑(乙腈、二甲基亞砜和水)中,LipiDye II則表現(xiàn)出弱熒光強度和紅移熒光。

圖C:用LipiDye II對細胞染色,在熒光顯微鏡下約500?nm處觀察細胞中LDs的發(fā)射光譜。

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●?LipiDye II的光穩(wěn)定性

分別使用 LipiDye II(紅)、舊版LipiDye(藍)和傳統(tǒng)LD?dye B(灰)對提前固定在4%?甲醛中的3T3-L1脂肪細胞進行染色;然后用共聚焦顯微鏡(Ex.?473 nm/Em 490-540 nm)反復采集同一區(qū)域脂肪細胞的Z-stack成像,觀察熒光強度的變化。傳統(tǒng)染料B的熒光強度在5次Z-stack成像后,熒光強度顯著降低;舊版LipiDye在經(jīng)過50次Z-stack成像后,其熒光強度則逐漸降低約60%。而LipiDye II 即使經(jīng)過50次(共500次光照射),其熒光強度幾乎沒有任何變化。證明LipiDye II非常適用于長時間的延時成像,具有超強的光穩(wěn)定性。

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?LipiDye II的細胞毒性

使用不同濃度的LipiDye II培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞24小時。隨后用MTT法評估細胞活力。結(jié)果顯示LipiDye II

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●?活細胞和PFA固定細胞染色

使用LipiDye II染色在活細胞狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細胞,進行活細胞成像。然后用4%?PFA固定3T3-L1脂肪細胞,再次進行熒光觀察(Ex. nm/Em 490-540 nm)。細胞在固定前后的熒光強度幾乎沒有任何變化,證明LipiDye II可用于活細胞染色,也可用于活細胞成像后的任何免疫細胞化學實驗。

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LipiDye?染色的活細胞和經(jīng)PFA固定后的熒光強度的對比

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??應用數(shù)據(jù)

●?LipiDye II在不同細胞中的染色

使用LipiDye II(1μM)分別對3T3-L1、HepG2、COS-7和HeLa細胞染色12小時,隨后在熒光顯微鏡下觀察(Ex. 473 nm/Em 490-540 nm;比例尺:20μm)。在HepG2細胞染色前一天,使用棕櫚酸(0.33 mM)/油酸(0.66 mM)處理誘導脂滴形成;HeLa細胞中,可清晰觀察到約1 μm的微小LDs(比例尺:5μm)。

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●?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)標記的多色成像

用LipiDye II(1 μM)對表達ER駐留熒光蛋白(mKO1)的COS7細胞染色12小時。然后使用共聚焦顯微鏡觀察COS7細胞(LipiDye II:Ex. 473 nm/Em 490-540 nm;mKO1:?Ex. 635 nm/Em 660-710 nm)。在ER的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中可以觀察到?< 1 μm的微小LDs。(比例尺:20 μm、5 μm和1 μm)

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●?LipiDye II在脂肪細胞分化和成熟過程中的長時間染色

使用含LipiDye II(1μM)的培養(yǎng)基誘導3T3-L1前脂肪細胞分化為3T3-L1成熟脂肪細胞。含LipiDye II的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)前脂肪細胞2天后,每隔2天用含LipiDye II的維持培養(yǎng)基,在共聚焦激光顯微鏡下觀察8天。結(jié)果證明,LipiDye II可以對活細胞進行長時間處理,觀察脂滴的成熟過程。整個分化過程中沒有出現(xiàn)對細胞的毒性作用,同時也沒有影響細胞的分化。

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●?脂肪生成的Z-stack成像

使用含LipiDye II(1μM)的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞24小時,并進行Z-stack成像。分化約10小時后,通過共聚焦顯微鏡(Ex. 473 nm/Em 490-540 nm)觀察到有微小的LDs生成(650分鐘,白色箭頭);同時可觀察到各脂滴在相互作用,逐漸變大的動態(tài)(1050~1450分鐘,黃色箭頭)。

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●?脂肪分解的Z-stack成像

將3T3-L1脂肪細胞和LipiDye II(1μM)共同孵育,然后用腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forskolin,10 μM)和磷酸二酯酶抑制劑IBMX(100 nM)處理細胞來增加脂肪細胞內(nèi)cAMP的濃度,從而促進三酰甘油的水解。

添加Forskolin和IBMX后,立即使用共聚焦顯微鏡(Ex. 473 nm/Em 490-540 nm)進行Z-stack成像(持續(xù)800分鐘,共3000幅圖像)。兩小時后,觀察到許多微小LDs形成(比例尺:5 μm)。

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●?STED 超分辨率顯微成像微小脂滴

用LipiDye II(1μM)對HeLa細胞進行染色。通過激光共聚焦顯微鏡(Ex. 473 nm/Em 490-540 nm)和STED超高分辨率顯微鏡(Ex.473 nm/ Em?500-640 nm、STED 660 nm)觀察微小脂滴。STED 成像可檢測到半峰全寬(FWHM)約120?nm的微小脂滴,而共聚焦顯微鏡無法清晰檢測。(關(guān)于STED顯微鏡的觀察條件及分析方法,請見參考文獻)

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●?利用熒光酶標儀對細胞脂滴進行半定量分析

首先將三種細胞株(人腎癌細胞786-O、小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a和中國倉鼠卵巢細胞CHO)分別以1 x 104個細胞/孔的數(shù)量接種到96孔板中,并在含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)24小時,再用10~200 μM 油酸處理細胞24小時,以促進脂滴的生長。然后用含有2% FBS/DMEM 的5 μM LipiDye II染色2小時。PBS沖洗細胞兩次,用熒光酶標儀測量熒光強度(Ex 420 ±5 nm/Em 503 ±10 nm)。結(jié)果顯示在這三種細胞中觀察到脂滴對油酸具有劑量依賴性。

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??參考文獻

1. Taki et al.,ACS. Mater. Lett.., 3, 42-49 (2021), Fused Thiophene-S,S,-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets

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