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蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程 Part1:實驗方案

2024-08-05
瀏覽次數(shù): 23

蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)保姆級教程

Part1:實驗方案

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蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體,以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白。

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我們的Western Blot實驗方案包含蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、檢測(圖1)及所涉及的試劑,為您的WB實驗保駕護航。


蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實驗方案

圖1、Western Blot實驗步驟


● 蛋白提取

1、使用Trident Extraction Kits從樣本(細胞或組織)中提取蛋白。

(注:根據(jù)蛋白與抗體的具體情況優(yōu)化細胞數(shù)量以及上樣量)

2、蛋白濃度定量,在-20℃或更低溫度下冷凍保存。

3、在樣品中加入Trident Sample Buffer,100℃煮沸5mins,使蛋白質(zhì)變性;瞬時離心上樣。

(注:必要時,使用前在Trident Sample Buffer加入二硫蘇糖醇(DTT)或/3-巰基乙醇(2-ME))

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●?相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

GTX400005

Trident RIPA Lysis Buffer

100ml

GTX400033

Trident RIPA Lysis Buffer (Low SOS)

250ml

GTX00835

Trident High-Efficiency Exosome Precipitation Reagent

20ml

GTX16357

Trident 6x?Laemmli SOS Sample Buffer

25ml

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●?SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜

1、將30 μg蛋白或 100 ng純化蛋白裝入SDS-PAGE凝膠孔中。

在SDS-PAGE凝膠孔中加入適量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder(高范圍:GTX50875 或標準范圍:GTX49384)裝入1個或多個額外的泳道中。

2、使用1x?Running buffer以50-100 V的電壓運行1-2小時。建議將電壓調(diào)低并延長時間。可使條帶更清晰,分辨率更高。

3、在Transfer buffer中將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或甲醇漂洗過的PVDF膜上。

(可選:在進行下一步之前,通過 Ponceau Red染色確認蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移成功)

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●?相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

GTX16370

Trident 20% SOS (w/v)

500ml

GTX50875

Trident Prestained Protein Ladder (High Range)

500μI

GTX49384

Trident Prestained Protein Ladder (Standard Range)

500μI

GTX16376

Trident Blue Prestained Protein Ladder

500μI

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蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實驗方案

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●?封閉、孵育抗體、洗膜

1. 封閉:在3%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中封閉30-60分鐘。

2. 一抗孵育:將膜置于含適當稀釋一抗的1%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中,在RT下孵育兩小時或在4°C下過夜。

3. 洗膜:1x?PBST ,一次10分鐘,兩次5分鐘。

4. 二抗孵育:將膜置于含適當稀釋二抗的1%脫脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中孵育1小時。

5. 洗膜:1x?PBST ,三次,每次10分鐘。

(注:Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何動物血清,適用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF實驗)

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●?相關(guān)產(chǎn)品


貨號

名稱

規(guī)格

GTX30963

Trident Universal Protein Blocking Reagent (animal serum-free)

100ml

GTX30977

Trident 10x?PBST

100ml

GTX30976

Trident 10x?TBST

100ml

GTX213110-01

Goat Anti-Rabbit lgG antibody (HRP)

1ml

GTX213111-01

Goat Anti-Mouse lgG antibody (HRP)

1ml

GTX224125-01

Rabbit Anti-Rat lgG antibody (HRP)

1ml

GTX224126-01

Rabbit Anti-Chicken lgY antibody (HRP)

1ml

GTX232040-01

Donkey Anti-Goat lgG antibody (HRP)

1ml

GTX221666-01

EasyBlot anti Rabbit lgG (HRP)

250μI , 50μI

GTX221667-01

EasyBlot anti Mouse lgG (HRP)

250μI , 50μI

GTX628474-01

EasyBlot anti Rat lgG (HRP)

250μI , 50μI

GTX628547-01

EasyBlot anti Goat lgG (HRP)

250μI , 50μI

GTX628906-01

EasyBlot anti Sheep lgG (HRP)

250μI , 50μI



?蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實驗方案?

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●?基于ECL成像

按照Trident plus Western HRP Substrate(GTX400006)或Trident femto Western HRP Substrate(GTX14698)來檢測信號。


貨號

名稱

規(guī)格

GTX400006

Trident plus Western HRP Substrate

500ml

GTX17435

Trident pico Western HRP Substrate

100/500ml

GTX14698

Trident femto Western HRP Substrate

100/200ml

蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 保姆級教程  Part1:實驗方案






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