試劑:CleanAmp? PCR Kit
儀器:Mastercycler? ep realplex4?S qPCR instrument
分子診斷需求的不斷增長(如新冠核酸檢測),要求所用檢測試劑、設(shè)備能在更短的時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的、可重復(fù)的檢測結(jié)果。這種需求下,多重實(shí)時(shí)PCR(Multiplex qPCR)是一項(xiàng)很有用的技術(shù),可省時(shí)、省力、省樣本,還能降低成本。然而盡管多重qPCR檢測技術(shù)有著諸多優(yōu)點(diǎn),但實(shí)際應(yīng)用時(shí)卻需要進(jìn)行很多的優(yōu)化來避免由于引物組增加而造成的擴(kuò)增效率下降的問題。Trilink的CleanAmp? dNTP試劑完美的解決了這一問題,本文展示了使用Trilink的CleanAmp? dNTP試劑和靈敏的qPCR儀器實(shí)現(xiàn)快速三重qPCR的案例。
CleanAmp? dNTP是Trilink運(yùn)用自己專業(yè)的核酸修飾技術(shù)開發(fā)的專利產(chǎn)品。
PCR的熱啟動,通常要通過使用熱啟動酶來實(shí)現(xiàn)。而在PCR實(shí)驗(yàn)中,簡單的將標(biāo)準(zhǔn)dNTP替換為CleanAmp? dNTP,即可獲得與使用昂貴的熱啟動酶相同的優(yōu)勢。CleanAmp? dNTP是經(jīng)過修飾的核苷三磷酸,該修飾可以在反應(yīng)初期阻止核苷酸摻入直至dNTP被熱激活,如此可極大地減少錯(cuò)誤引發(fā),避免引物二聚體形成以及其他可能的不良影響,從而在多重和快速PCR實(shí)驗(yàn)中具有非常好的性能。CleanAmp? PCR Kit試劑盒中提供CleanAmp? dNTP,并包括已成功驗(yàn)證過的DNA聚合酶。該試劑盒可以靈活地用于多種PCR檢測,包括快速和多重PCR。
Eppendorf realplex4?S?real-time PCR系統(tǒng)使用超快的珀?duì)柼?/span>Peltier)熱循環(huán)模塊,可以以6°C /秒的速度加熱并以4°C /秒的速度冷卻,在一小時(shí)內(nèi)即可完成標(biāo)準(zhǔn)的40循環(huán)qPCR反應(yīng)。珀?duì)柼?/span>模塊還可以確保溫度控制的精確性以及較高的模塊均質(zhì)性,這對于高質(zhì)量PCR反應(yīng)至關(guān)重要。該系統(tǒng)的光學(xué)模塊是一個(gè)由96個(gè)LED 組成的陣列,這些LED可以預(yù)先選擇并均衡,以使它們可以均勻的激發(fā)所有樣本孔。這種設(shè)置消除使用其他常規(guī)qPCR儀器時(shí),需要用ROX作為校正染料的必要性。Realplex4?S還使用了光電倍增管(PMT)進(jìn)行信號檢測,這是目前可用的最靈敏,最經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)。
為了進(jìn)一步探索CleanAmp? PCR試劑盒和Eppendorf realplex4?S?real-time PCR系統(tǒng)的優(yōu)勢,本文的研究以這兩種技術(shù)的結(jié)合為特色,在30分鐘內(nèi)完成可重復(fù)性的實(shí)時(shí)三重PCR的檢測。
方法
使用CleanAmp?的dNTP試劑盒與水解探針在realplex4?S?real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)三重PCR檢測。使用CleanAmp? PCR試劑盒擴(kuò)增了三個(gè)小鼠基因組DNA靶標(biāo),分別為125、185和214個(gè)堿基對。實(shí)驗(yàn)分兩組進(jìn)行:首先,分別使用標(biāo)準(zhǔn)和快速PCR對三個(gè)靶標(biāo)同時(shí)進(jìn)行三重?cái)U(kuò)增(圖1)。其次,使用快速PCR對三個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增和單個(gè)擴(kuò)增(圖2)。所有反應(yīng)均在帶有Master clear?蓋條的Eppendorf實(shí)時(shí)PCR管條中通過使用水解探針進(jìn)行檢測:125 bp(6-JOE; 0.2 μM),185 bp(FAM; 0.05 μM)和214 bp(ROX; 0.2 μM)。
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首先,對標(biāo)準(zhǔn)和快速循環(huán)流程下的三重qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評估。所有反應(yīng)均設(shè)置一式四份,并使用小鼠基因組DNA的5倍系列稀釋液為樣本,范圍從320 pg至1.0 μg。標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)qPCR實(shí)驗(yàn)的方案按照CleanAmp? PCR試劑盒產(chǎn)品說明書中的“多重PCR方案” (1X PCR緩沖液(10 mM Tris-HCl(pH 8.3),50 mM KCl和2.5 mM MgCl2),0.4 mM CleanAmp? dNTP,0.01 U / μL Taq DNA聚合酶和0.2 μM引物,25 μL)。在快速多重PCR實(shí)驗(yàn)方案在上述方案的基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下改變:70 mM KCl,4.0 mM MgCl2,0.6 mM CleanAmp? dNTP,0.33 U /μL U?Taq DNA聚合酶,引物(125 bp和185 bp組為0.5 μM,214 bp引物組為0.7 μM),15 μL)。
其次,在快速循環(huán)條件下進(jìn)一步評估CleanAmp? dNTP試劑盒,分別以單重和多重反應(yīng)擴(kuò)增三個(gè)相同的靶標(biāo)。依然使用小鼠基因組DNA的5倍系列稀釋液為樣本,范圍從320 pg至200 ng,并設(shè)置三重復(fù)??焖傺h(huán)條件和熱循環(huán)條件按照如上所述方案的進(jìn)行。對于單重反應(yīng),遵循CleanAmp? PCR Kit產(chǎn)品說明書中的“快速熱循環(huán)方案” (1x PCR緩沖液(10 mM Tris-HCl(pH 8.3),50 mM KCl和4.0 mM MgCl2),0.4 mM CleanAmp ? dNTPs,0.33 U / μL Taq DNA聚合酶和0.5 μM引物,15 μL體系)。
結(jié)果與結(jié)論
對比標(biāo)準(zhǔn)和快速兩個(gè)條件下的三重?qPCR的結(jié)果顯示:兩者分別在1 h 26 min和24 min的熱循環(huán)時(shí)間內(nèi)得到穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。在兩種反應(yīng)條件下,擴(kuò)增曲線間隔良好,重復(fù)緊密。R2值顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線符合良好的線性,且不同靶標(biāo)、不同檢測的擴(kuò)增效率相當(dāng)(Figure.1)。同樣在快速循環(huán)條件下分別進(jìn)行的單指標(biāo)和三重指標(biāo)的擴(kuò)增結(jié)果也類似:對于每個(gè)靶濃度,單指標(biāo)和三重指標(biāo)的擴(kuò)增曲線重合,如圖2所示。因此,每個(gè)反應(yīng)相似的Cq值反應(yīng)了不同反應(yīng)的擴(kuò)增效率的一致性,如表(圖2B)所示。這些發(fā)現(xiàn)展示CleanAmp? PCR試劑盒的多功能性和Mastercycler? ep realplex4 qPCR儀的速度,兩者相互補(bǔ)充,僅在24分鐘內(nèi)就能獲得高效、可重復(fù)的三重qPCR數(shù)據(jù)。
CleanAmp? PCR試劑盒和Mastercycler? ep realplex4 S qPCR儀的組合使我們能夠在保持與標(biāo)準(zhǔn)PCR或單指標(biāo)PCR中可得到的高擴(kuò)增效率的同時(shí),實(shí)現(xiàn)快速三重qPCR.
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